HPV（16/18）E6、PKR、p-PKR、p-EIF2α在宫颈病变组织表达的意义

罗远材，瞿全新，糜若然

（1.天津医科大学一中心临床学院妇产科，天津 300192；2.天津医科大学总医院）

临床实践发现，随宫颈病变程度增加，HPV感染的检出率增加，尤其在宫颈癌患者，应用PCR的方法，HPV的检出率甚至接近100%。PKR→p-PKR→p-EIF2α传导通路作为机体抵御病毒感染的重要防线，其在HPV感染状态下能否被有效激活及PKR、p-PKR、p-EIF2α表达水平与宫颈病变级别、宫颈癌患者预后的相关性仍不明确。本研究通过检测HPV（16/18）E6、PKR、p-PKR、p-EIF2α在宫颈病变组织的表达情况，阐明彼此之间的相互关系，在宫颈癌发生、发展中的作用及对宫颈癌患者预后的影响。

1 资料与方法

1.1 研究对象 收集2004年3月～2008年6月在天津市第一中心医院、天津医科大学总医院因宫颈病变行开腹手术或宫颈活检、锥切的存档病理石蜡块177例及其完整的病例资料。177例中宫颈癌63例，包括鳞癌55例，腺癌8例，年龄21～76岁，平均（50.7±18.6）岁。FIGO分期：Ⅰ期13例（Ⅰa24例、Ⅰb15例、Ⅰb24例），Ⅱ期34例（Ⅱa13例、Ⅱb21例），Ⅲ期13例（Ⅲa2例、Ⅲb11例），Ⅳ期3例（Ⅳa1例、Ⅳb2例）；癌细胞分化程度：高分化24例，中低分化39例；原发瘤直径≤4cm 47例，＞4cm 16例。宫颈CINⅠ39例，年龄20～56岁，平均（34.1±10.8）岁。CINⅡ35例，年龄21～57岁，平均（37.6±13.2）岁。CINⅢ40例，年龄25～75岁，平均（41.2±11.7)岁。另收集因良性病变行子宫切除的正常宫颈组织15例。所有标本均经经验丰富的高年资病理医师诊断证实。

1.2 试剂与方法

知识产权的基本理念与反不正当竞争扩展保护之限度——兼评“金庸诉江南”案 .....................................王太平 10.03

1.2.1 主要试剂 小鼠抗人PKR单克隆抗体购自美国R&D Systems公司，小鼠抗人HPV(16/18)E6单克隆抗体、兔抗人p-PKR（Thr446）、兔抗人p-EIF2a（Ser51）多克隆抗体购自美国Santa Cruz生物公司，SP-9001、SP-9002免疫组化染色试剂盒、ZLI-9032浓缩型DAB显色试剂盒均购自北京中杉生物公司，阳性切片由天津市第一中心医院病理室提供。

2.3 HPV（16/18）E6、PKR、p-PKR、p-EIF2α表达与宫颈癌患者预后 宫颈癌Ⅰa2～Ⅱa期患者先行手术治疗，后辅以放疗或放化疗结合治疗；Ⅱb期及以上患者行放疗或放化疗结合治疗。63例宫颈癌患者在门诊接受随访，检查内容包括血常规、妇科检查、腹腔盆腔彩超、胸片等，必要时检查肿瘤标记及盆腔CT。随访3～42个月，病情进展（患者因病死亡或临床症状加重，肿瘤标记物升高，肿瘤体积增大或出现新的转移灶、新的淋巴结转移等）31例，Ⅰ～Ⅱ期17例，Ⅲ～Ⅳ期14例；其中死亡12例，Ⅰ～Ⅱ期3例，Ⅲ～Ⅳ期9例。经卡方检验，Ⅲ～Ⅳ期病情进展率高于Ⅰ～Ⅱ期（P＜0.01）。HPV（16/18）E6表达阳性者病情进展率高于其表达阴性者（P＜0.05），p-PKR、p-EIF2α表达阳性者病情进展率低于其表达阴性者（P＜0.05，P＜0.05），见表3。

2.1 宫颈各级别病变组织中HPV（16/18）E6、PKR、p-PKR、p-EIF2a的表达 HPV（16/18）E6在宫颈癌组的阳性表达率高于正常宫颈组及CINⅠ组（P＜0.01，P＜0.05），与其余各组比较差异无统计学意义（P＞0.05）；PKR在宫颈癌组的阳性表达率高于正常宫颈组及CINⅠ、Ⅱ组（P＜0.01，P＜0.01，P＜0.05），与CINⅢ组比较差异无统计学意义（P＞0.05）；p-PKR蛋白在正常宫颈、CINⅠ-Ⅲ、宫颈癌的阳性表达率分别为6.7%、15.4%、20.0%、15.0%、15.9%，各组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；p-EIF2α在CINⅢ组的阳性表达率高于正常宫颈组（P＜0.05），与其余各组比较差异无统计学意义（P＞0.05）；在宫颈癌组，PKR的阳性表达率显著高于p-PKR（P＜0.01）；HPV（16/18）E6、PKR的阳性表达率与宫颈病变程度成正相关（P＜0.05,P＜0.05），p-PKR、p-EIF2a的阳性表达率与宫颈病变程度无明显相关性（P＞0.05，P＞0.05），见表1。

1.4 统计学处理 采用SPSS13.0软件包对所得数据进行统计分析。计数资料采用χ2检验，相关比较采用Spearman等级相关进行统计分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

1.3 结果判定 在400倍光学显微镜下随机选取8个视野，每个视野观察100个细胞，计数阳性细胞，取平均值。将阳性细胞按其染色数量和显色强度分别评分，两项相加，0～1分为(－)，2～3分为(＋)，4～5分为(＋＋)，6～7分为(＋＋＋)，(＋～＋＋＋)均为阳性[1]。

1.2.2 方法 将所有病理组织标本的石蜡块连续切片，厚度约为3～4μm，用APES防脱片胶处理的载玻片捞片后置于60℃的恒温烤箱内烤片，使组织标本与载玻片紧密粘附。组织切片经脱腊处理后在高温高压下进行抗原修复，然后按SP三步法免疫组化染色试剂盒说明书提供的实验步骤进行操作。TBS代替一抗做空白对照。一抗工作液浓度1∶100。

2 结果

地理国情要素和地表覆盖数据虽属2类成果，但它们之间存在必然的逻辑关系。例如，地理国情要素中的道路中心线应位于地表覆盖道路图斑面内，地理国情要素中水域的高水界应大于地表图斑中水面的范围，地理国情要素中单位院落的点位应位于地表覆盖数据中房屋建筑的范围内等。在检查中，经常发现在此类要素中会出现逻辑约束关系不合理现象。作业时，应重点关注此类要素的联动更新问题，切勿顾此失彼。

表1 各组患者HPV（16/18）E6、PKR、p-PKR、p-EIF2α的阳性表达[n(%)]

HPV是一种重要的致瘤病毒，也是宫颈病变患者检出的最常见病毒之一，其突破机体抗病毒的防御机制持续感染，无疑在宫颈癌的发生及演进过程中起至关重要的作用。Cestero[2]指出：高危型HPV（HR-HPV）持续感染是低级别CIN发展为CINⅢ、甚至宫颈浸润癌的关键因素，单独一种HR-HPV感染阳性妇女在4年内发展为CINⅢ的危险性为4.3%，10年的危险性>7%，而HR-HPV感染阴性妇女发展为CINⅢ的危险可以忽略不计。因此，HR-HPV是推动宫颈由低级别病变向高级别病变发展并最终导致宫颈癌的最重要因素。

这是美国为重启本轮对伊朗制裁而设立的临时性过渡机制，根据是现代法治国家普遍承认的“法无溯及力”的基本原则，即法律一般情况下不应对生效之前相关主体的行为造成不利的后果。《伊朗核协议》第37条中也有类似规定，即缔约国在按照《伊朗核协议》的纠纷处理机制（退出《伊朗核协议》并）重启对伊朗的制裁时，“不得溯及缔约国和伊朗之间在《伊朗核协议》生效期间签署的合同”，前提是这些合同的签订和履行须符合《伊朗核协议》和联合国安理会决议的规定。

表2 宫颈癌患者不同临床病理特征HPV（16/18）E6、PKR、p-PKR、p-EIF2α的表达[n(%)]

表3 HPV（16/18）E6、PKR、p-PKR、p-EIF2α表达与宫颈癌患者预后[n(%)]

3 讨论

2.2 宫颈癌患者不同临床病理特征 HPV（16/18）E6、PKR、p-PKR、p-EIF2α的表达 肿瘤直径≤4cm时，HPV（16/18）E6、PKR阳性表达率低于肿瘤直径＞4cm者（P＜0.05，P＜0.05）；HPV（16/18）E6、PKR、p-PKR、p-EIF2α的阳性表达率在患者年龄、病理类型、癌细胞分化程度、临床分期等差异无统计学意义（P＞0.05）,见表2。

做为机体防御机制中的重要分子，PKR在细胞生长、分化、凋亡以及抵御病毒感染、抗肿瘤方面均发挥重要的生物学效应。PKR是一种干扰素诱导的dsRNA激活的蛋白激酶，与dsRNA有很高的亲和力，激活后表现出抗病毒和抗增殖活性，可作为病毒感染的标志。无活性的PKR是一种折叠锁样构型，在病毒复制过程中产生的dsRNA可与PKR结合并诱使其分子构型发生改变，导致多个丝氨酸、苏氨酸位点自动磷酸化而被激活，其中以第446位苏氨酸残基磷酸化最为重要[3-4]。激活的PKR（即p-PKR）能识别并诱使EIF2α第51位丝氨酸残基磷酸化，磷酸化的EIF2α（即p-EIF2α）增加了对翻译起始因子EIF2B的亲和力，EIF2B是一种EIF2-GDP→EIF2-GTP循环需要的鸟嘌呤核苷酸转换因子，EIF2α51位丝氨酸磷酸化俘获了EIF2-GDP和EIF2B形成的复合物，减弱了鸟嘌呤核苷酸转换因子活性，使EIF2-GTP水平下降，抑制翻译启动过程，最终导致蛋白合成完全受到抑制[4]。通过抑制蛋白合成、诱导感染细胞凋亡是PKR抑制病毒复制的主要机制[5]。激活的PKR抑制细胞增殖、通过凋亡损毁细胞；而PKR阴性突变则可促使细胞恶性转化和肿瘤形成[3]。PKR在组织内的表达受Ⅰ型干扰素调控，被认为是抑制病毒的关键靶点和肿瘤抑制剂，是宿主防御机制中发动细胞死亡来对抗病毒感染和肿瘤形成的关键点。本文p-PKR、p-EIF2α表达结果及宫颈癌患者随访资料显示：p-PKR、p-EIF2α表达阳性者，病情相对稳定，表明PKR→p-PKR→p-EIF2α传导通路的有效激活对遏制病情进展有积极作用。

PKR主要定位于细胞质，细胞核内亦有少量表达，但可能与使EIF2α磷酸化无关；细胞质也是PKR被dsRNA激活及使其作用底物EIF2α磷酸化的主要场所[5]。为建立持续稳定的感染，多种病毒进化出一系列不同的机制抑制PKR功能：如产生dsRNA拮抗剂；抑制PKR二聚化；干扰PKR与EIF2α结合；抑制PKR表达或诱导PKR降解等。研究发现：HPV18E6蛋白能通过使p-PKR去磷酸化的方式拮抗PKR对蛋白合成的抑制和其诱导的细胞凋亡，大大削弱了凋亡基因依赖于EIF2α途径的促凋亡作用[4]。本组数据显示，随宫颈病变级别增加，HPV（16/18）E6表达增加，与相关报道一致；而在宫颈高级别病变尤其是宫颈癌组织中，p-PKR、p-EIF2α表达降低，表明PKR、EIF2α明显激活不足，可能与HPV（16/18）E6高表达抑制PKR、EIF2α磷酸化有关，是导致细胞恶性转变的关键所在。非激活型PKR的表达可受病毒感染、细胞增殖、应激刺激等多种因素影响，本文PKR在宫颈高级别病变组织的高表达可能为宿主细胞受不断升高的HPV16/18感染及肿瘤细胞增殖负荷等刺激所表现的应激反应，而p-PKR、p-EIF2α呈较低水平表达，应为HPV16/18感染所进化出的自身防御机制使PKR、EIF2α激活障碍或p-PKR、p-EIF2α去磷酸化失活所致，由此导致PKR→p-PKR→p-EIF2α传导通路不能充分、有效激活。受病毒感染细胞因失去p-EIF2α对其的负调控作用，持续存活，病毒感染扩散，病变细胞恶性转化，肿瘤组织体积增大，使病变沿着低级别CIN→高级别CIN→宫颈癌的方向发展。由此可见，HR-HPV失活PKR传导通路的最终结果是使病毒感染扩散，病毒基因有机会整合入宿主细胞基因组内，表达病毒癌蛋白，破坏细胞周期自我调控和凋亡机制，延缓细胞死亡，通过干扰某些致癌或抑癌因子，导致某个细胞克隆发生永生化，并使其有机会积累内在或外在的致癌因子对其的致癌作用，最终发生癌变。

必须努力把握水利现代化建设的正确方向。水利现代化是整个经济和社会现代化的重要组成部分，水利现代化的过程就是与经济社会协调、可持续发展的过程。水利为经济社会现代化发展所提供的保障能力，是衡量一个地区水利现代化建设水平的主要标准。从这个意义上说，水利现代化只有阶段性的工作目标，没有终极性的工作标准。因此，推进水利现代化建设，必须坚持“三个紧紧围绕”，即紧紧围绕经济社会现代化发展战略，紧紧围绕农业现代化和新农村建设，紧紧围绕人民群众追求幸福生活的新要求，建设符合科学发展要求的水利现代化，建设老百姓想要的水利现代化。

因此，HPV（16/18）E6在宫颈病变组织的高表达会抑制PKR传导通路激活，促进宫颈病变进展，以致发生宫颈癌，并对宫颈癌患者预后构成负面影响；p-PKR、p-EIF2α能抑制病情进展，改善其预后。

［1］ Betz BL,Strobeck MW,Reisman DA,et al.Re-expression of hSNF5/ InI1/BAF47in pediatric tumor cell leads to G(1)arrest associated with induction of p16ink4a and activation of RB[J].Oncogene, 2002,21(34):5193

［2］ Cestero RM.Risk of high-grade cervical intraepithelial neoplasia (CIN2/3)or cancer during follow-up of human papillomavirus（HPV）infection or CIN1[J].Am J Obstet Gynecol，2006，195(5): 1196

［3］ Su QZ,Wang S,Baltzis D,et al.Tyrosine phosphorylation acts as a molecular switch to full-scale activation of the eIF2α RNA-dependent protein Kinase[J].PNAS,2006,103(1):63

［4］ Kazemi S,Papadopoulou S,Li SY,et al.Control of α subunit of eukaryotic translation initiation factor 2(eIF2)α phosphorylation by the human papillomavirus type 18E6oncoprotein:implications for eIF2α-dependent gene expression and cell death[J].Mol Cell Biol, 2004,24（8）：3415

［5］ Hakki M，Marshall EE,Niro KLD,et al.Binding and nuclear relocalization of protein kinase R by human cytomegalovirus TRS1[J].J Virol,2006,80（23）：11817