高渗条件下利用蔗糖提升2-酮基-L-古龙酸生产效率

陈克杰，周景文，刘立明，刘杰，堵国成，陈坚

1 江南大学 食品科学与技术国家重点实验室，无锡 214122

2 江南大学 工业生物技术教育部重点实验室，无锡 214122

3 江苏江山制药有限公司，靖江 214500

工业生物技术

高渗条件下利用蔗糖提升2-酮基-L-古龙酸生产效率

陈克杰1,2，周景文1,2，刘立明1,2，刘杰3，堵国成2，陈坚1,2

1 江南大学 食品科学与技术国家重点实验室，无锡 214122

2 江南大学 工业生物技术教育部重点实验室，无锡 214122

3 江苏江山制药有限公司，靖江 214500

旨在进一步提升维生素C前体2-酮基-L-古龙酸 (2-KLG) 的生产效率。在详细考察了2-KLG工业化生产过程中渗透压变化规律的基础上，研究了高渗对混合菌系细胞生长和2-KLG合成的影响，提出蔗糖促进伴生菌巨大芽胞杆菌Bacillusmegaterium生长，进而促进普通生酮古龙酸菌Ketogulonigenium vulgare生长和产酸的策略。结果表明，2-KLG的积累和碱性物质的流加使渗透压上升了832 mOsmol/kg；高渗抑制了巨大芽胞杆菌的生长 (15.4%)，从而抑制普通生酮古龙酸菌 (31.7%) 的生长，导致2-KLG产量和生产强度分别下降67.5%和69.3% (以1 250 mOsmol/kg为例)；蔗糖的添加则显著促进巨大芽胞杆菌的生长，使高渗条件下 (摇瓶，1 250 mOsmol/kg) 2-KLG产量 (40.6 g/L) 提高87%；在3 L发酵罐中，补加10 mmol/L蔗糖使2-KLG发酵周期缩短10.8%，2-KLG生产强度提高10.4%。研究成果为在环境胁迫下提高混菌生产目标代谢产物的产量提供了潜在的策略。

混菌发酵，2-酮基-L-古龙酸，碳源调节，维生素C，高渗

Abstract:This study aimed to further enhance 2-keto-L-gulonic acid (2-KLG) production efficiency. A strategy for enhancingKetogulonigenium vulgaregrowth and 2-KLG production by improvingB. megateriumgrowth with sucrose was developed based on the time course of osmolality during 2-KLG industrial scale fermentation and effects of osmolality on cells growth and 2-KLG production.Results showed that the accumulation of 2-KLG and the feeding of alkaline matter led to an osmolality rise of 832 mOsmol/kg in the culture broth. High osmotic stress (1 250 mOsmol/kg) made the growth ofB. megateriumandK. vulgaredecreased 15.4% and 31.7%, respectively, and consequently the titer and productivity of 2-KLG reduced 67.5% and 69.3%, respectively. When supplement sucrose under high osmotic condition (1 250 mOsmol/kg),B. megateriumgrowth was significantly improved, with the result that2-KLG production was increased 87%. Furthermore, by applying this sucrose addition strategy further to batch fermentation in 3 L fermentor, the productivity of 2-KLG increased 10.4%, and the duration of fermentation declined 10.8%. The results presented here provide a potential strategy for enhancing the target metabolites produced by mixed strains at environmental stress.

Keywords:mixed culture, 2-keto-L-gulonic acid, carbon source regulation, Vitamin C, hyperosmotic stress

维生素C工业化生产普遍采用“二步发酵”工艺，即L-山梨糖到维生素C前体—2-酮基-L-古龙酸(2-keto-L-gulonic acid，2-KLG) 的转化由普通生酮古龙酸菌 (Ketogulonigenium vulgare，俗称小菌，原来鉴定为Gluconobacter oxydans) 和巨大芽胞杆菌(Bacillusmegaterium，俗称大菌) 组成的混合菌系来完成[1]。而在典型2-KLG生产的速率模型中，L-山梨糖浓度与产酸速率为拟零级动力学关系，表明2-KLG合成速率与发酵液中底物浓度无关，而与菌体浓度成正比[2]。因此，2-KLG的生产通常采用发酵液中L-山梨糖浓度处于最适范围，通过补料分批发酵的模式，以维持较高的2-KLG合成速率[3]。类似于有机酸发酵，2-KLG发酵过程中需流加一定的NaOH或Na2CO3等碱性物质以维持发酵液中pH处于合适的生理范围内。而随着发酵体系中2-KLG和Na+浓度的持续增加，导致渗透压也持续上升，进而影响菌体生长、细胞形态、膜流动性、代谢流分配和目标代谢产物的合成[4-6]。因此，如能在充分理解2-KLG发酵过程中渗透压的变化规律及其对混合菌系生理代谢功能影响的基础上，发展高效合理的调控策略，有望进一步提高2-KLG生产效率。

本文在研究了2-KLG工业化生产过程中渗透压的变化规律和高渗条件下混合菌系代谢行为 (菌体生长和2-KLG合成) 的基础上，针对性地提出碳源调节策略，实现了促进巨大芽胞杆菌生长，增加活性物质分泌，增强混菌耐高渗能力，提升2-KLG生产效率的目的。这一研究结果为在混菌发酵体系中调控渗透压等环境因素促进目标代谢产物的高效合成提供了研究思路。

1 材料与方法

1.1 菌种

普通生酮古龙酸菌 (K. vulgare，俗称小菌)，巨大芽胞杆菌 (B. megaterium，俗称大菌)，由江苏江山制药有限公司 (江苏靖江) 提供。

1.2 培养基

种子培养基 (g/L)：L-山梨糖20，酵母膏3，牛肉膏3，大豆蛋白胨10，玉米浆1.5，尿素1，KH2PO41，MgSO42，CaCO31。

基础发酵培养基 (g/L)：L-山梨糖80，玉米浆5，尿素 12，KH2PO41，MgSO41，CaCO35。

用氯化钠作为渗透诱导剂时，根据需要适量添加。蔗糖补加浓度为10 mmol/L。以上所有培养基用自来水配置，由2 mol/L NaOH调pH值为6.7～7.0。碳源 (L-山梨糖) 和氮源分开灭菌，灭菌条件为121℃，15 min。

1.3 培养方法

1.3.1摇瓶培养

种子培养：先按划线法自然搭配巨大芽胞杆菌、普通生酮古龙酸菌，再从混菌斜面接种子培养基(75 mL/750 mL摇瓶)，30℃、200 r/min培养18 h。

发酵培养：将种液按接种量10%接入发酵培养基 (75 mL/750 mL 摇瓶)，30℃、200 r/min培养 72 h左右。定期取样检测相关参数。

1.3.2发酵罐培养

在3 L发酵罐 (韩国BioTron公司) 中进行。发酵罐初始装液量为2 L，接种量为10%。整个发酵过程中，通气 (1:0.8～1) 下，溶氧控制在30%～50%；温度控制在 (30±0.5)℃；接种后调pH 7.0，前期不控制 pH，产酸后 pH下降，自动流加 30% NaOH使 pH维持在 6.9～7.0；定期取样检测 2-KLG和 L-山梨糖的含量。当残糖浓度降到0.3%以下时，发酵结束。

1.4 分析方法

1.4.1菌体浓度测定

菌体浓度测定参见文献[7]。

1.4.2巨大芽胞杆菌和普通生酮古龙酸菌的计数

巨大芽胞杆菌和普通生酮古龙酸菌以结晶紫染色后，用血球计数板在显微镜下计数。

1.4.3渗透压测定

用冰点渗透压计 (德国Gonotec公司) 测定。

1.4.42-KLG与L-山梨糖含量的测定

采用Agilent 1200高效液相色谱仪测定[8]。色谱柱：Aminex HPX-87H (Bio-Rad)；流动相：0.005 mol/L H2SO4；流速：0.6 mL/min；柱温：35℃；进样量：5 μL；检测器：示差折光检测器。

1.4.5L-山梨糖到2-KLG转化率的计算[9]

2 结果

2.1 2-KLG积累是发酵体系中渗透压提升的主因

2-KLG工业化生产中相关发酵参数的变化趋势如图1A所示。典型的2-KLG发酵过程中，初始L-山梨糖浓度为15～25 g/L，发酵4～8 h后通过流加维持发酵过程中L-山梨糖浓度为15～30 g/L，36～44 h停止流加，直至发酵结束。发酵终点时渗透压与起始点比较，上升了832 mOsmol/kg。结合前述，发酵过程中渗透压的增加并非源于 L-山梨糖浓度的增加，因其浓度始终维持在一定范围，且发酵终点时浓度有所降低。2-KLG的不断分泌导致发酵体系pH不断下降，为了将维持pH在一定的生理范围内需不断流加NaOH，使得2-KLG的钠盐浓度不断增加，从而导致渗透压不断上升。进一步分析发现，发酵液中2-KLG浓度与渗透压值的增加呈良好的线性关系(图 1B)。这一结果表明，导致发酵液中渗透压升高的主要原因在于2-KLG的不断积累。

2.2 高渗对2-KLG发酵的影响

不同渗透压 (氯化钠诱导) 对混合菌系生长和2-KLG合成的影响如图2所示。当渗透压为1 250 mOsmol/kg时，稳定期OD660值为4.51，与对照组 (不加NaCl) 比较，下降了14.9%。相应地，2-KLG 产量 (21.6 g/L) 和生产强度(0.3 g/(L·h)) 均比对照组下降了67.5%和 69.3%。继续提高发酵液中的渗透压，细胞生长和2-KLG合成则进一步受到抑制，如渗透压大于1 400 mOsmol/kg时，2-KLG产量仅为10.3 g/L。

作者采用显微计数法进一步研究了高渗 (以1 250 mOsmol/kg为例) 对混合菌系生长的影响，结果如图3所示。与对照组比较：1)巨大芽胞杆菌的延迟期延长了9 h，普通生酮古龙酸菌延长了11 h；2)巨大芽胞杆菌对数期平均比生长速率下降了27.7%，普通生酮古龙酸菌下降了 52.9%；3) 巨大芽胞杆菌稳定期菌体数量下降了 15.4%，普通生酮古龙酸菌下降了 31.7%。上述结果表明，高渗显著抑制了普通生酮古龙酸菌的生长。然而，普通生酮古龙酸菌生长和合成2-KLG的能力取决于混合菌系中巨大芽胞杆菌的生长状况[10]。因此，高渗抑制普通生酮古龙酸菌生长和2-KLG合成的根本原因在于巨大芽胞杆菌生长受到抑制，导致活性物质分泌减少。鉴于此，高渗条件下如何调控巨大芽胞杆菌的生长，对2-KLG的高效生产就显得尤为重要。

图1 典型2-KLG工业发酵过程曲线 (A) 及渗透压与2-KLG含量的关系 (B)Fig.1 Time-course of 2-KLG fermentation process during industrial production (A) and the correlation between osmolality and the 2-KLG concentration (B).

图2 渗透压对混菌生长和2-KLG生产的影响Fig.2 Effect of osmolality on the mixed strains growth and the 2-KLG production.

2.3 蔗糖促进高渗条件下2-KLG生产

在2-KLG发酵体系中，巨大芽胞杆菌并不能利用L-山梨糖、仅能利用玉米浆中的碳源生长。玉米浆中还原糖的浓度约为11%[11]，因此作者选取并研究了玉米浆中典型碳源对高渗条件下 (以 1 250 mOsmol/kg为例) 混合菌系生长和2-KLG合成的影响，结果如表1所示。表1表明，碳源的添加有效地促进了混合菌系生长和2-KLG合成。但总体而言，二糖更能显著提高2-KLG的合成效率。

图3 高渗对混菌中巨大芽胞杆菌 (A) 和普通生酮古龙酸菌 (B) 生长的影响Fig.3 Effect of osmolality on the growth ofB. megaterium(A) andK. vulgare(B).

表1 高渗条件下不同碳源对2-KLG生产和混菌生长的影响Table 1 Effect of different carbon sources on the 2-KLG production and the mixed strains growth under 1 250 mOsmol/kg condition

基于上述结果，作者进一步研究了高渗条件(以1 250 mOsmol/kg为例) 下添加蔗糖对混菌生长和2-KLG合成的影响 (图4)。与未添加蔗糖的对照组 (1 250 mOsmol/kg) 比较，平稳期 (48 h) 混菌浓度、72 h时2-KLG含量 (40.6 g/L)、2-KLG生产强度、L-山梨糖消耗速率分别提高了73%、87%、95.0%和 88.9%。同时，蔗糖的添加也明显地提高了2-KLG对L-山梨糖的转化率。

图4 蔗糖促进高渗条件下2-KLG的生产Fig.4 Sucrose enhances the 2-KLG production under hyperosmotic stress (1 250 mOsmol/kg) induced by NaCl.

2.4 蔗糖提升分批发酵2-KLG生产效率

作者在3 L发酵罐中进一步研究了添加10 mmol/L蔗糖对2-KLG生产的影响 (图5和表2)。与未添加的对照组比较：1) 巨大芽胞杆菌稳定期细胞提高42%，普通生酮古龙酸菌稳定期细胞提高10.6%；2) 发酵周期由 37 h缩至 33 h，发酵时间缩短了10.8%；3) 转化率由 89.9%提高到 92.8%；4)2-KLG 生产强度由 1.87 g/(L·h)提高到 2.07 g/(L·h)，提高了10.4%。

图5 蔗糖补加对2-KLG混菌分批发酵的影响Fig.5 Effect of sucrose on the 2-KLG fermentation by mixed culture in 3 L fermentator. (A) 1, 2: 2-KLG; 3, 4: sorbose.

表2 3 L发酵罐上蔗糖对2-KLG发酵参数的影响Table 2 Effect of sucrose on the 2-KLG fermentation parameters by mixed culture in 3 L fermentator

3 讨论

作为一个典型的有机酸发酵过程，维生素C前体物质2-KLG发酵体系中pH因2-KLG的积累而不断下降，为了维持最适pH范围需不断流加的碱性物质则导致渗透压不断升高 (图 1)。不断升高的渗透压显著抑制了巨大芽胞杆菌和普通生酮古龙酸菌的生长，并最终限制了2-KLG的合成 (图3)。高渗对混合菌系中普通生酮古龙酸菌的毒害作用表现为：1) 渗透压对普通生酮古龙酸菌的“直接作用”：直接抑制普通生酮古龙酸菌生长和产酸；2) 渗透压对伴生菌巨大芽胞杆菌的“间接作用”：影响巨大芽胞杆菌生长以及活性物质的分泌，从而间接影响普通生酮古龙酸菌生长和产酸。2-KLG发酵中普通生酮古龙酸菌与巨大芽胞杆菌之间的关系体现在：1)普通生酮古龙酸菌具有高效合成2-KLG的全部酶系，但单独培养时生长非常微弱，且几乎难以合成2-KLG；2)巨大芽胞杆菌不具备合成 2-KLG的酶系，但能分泌活性物质促进普通生酮古龙酸菌生长和合成 2-KLG；3) 普通生酮古龙酸菌生长和合成2-KLG的能力随着发酵初期混合菌系中巨大芽胞杆菌比例的增加而增加；4) 巨大芽胞杆菌裂解释放的胞内活性物质对普通生酮古龙酸菌细胞生长和L-山梨糖脱氢酶活性具有强烈的促进作用[12-13]，且发酵体系中活性物质的丰度直接决定普通生酮古龙酸菌合成2-KLG的效率。基于此，如何在高渗条件下提高2-KLG合成效率的着眼点在于保证巨大芽胞杆菌的充分生长，以提供高丰度的生物活性物质。混合菌系中巨大芽胞杆菌仅能利用玉米浆中的碳源。因此，培养体系中充足的碳源对巨大芽胞杆菌的生长就显得尤为重要。作者在分析玉米浆中碳源种类及其对巨大芽胞杆菌和普通生酮古龙酸菌生长影响的基础上，发现高渗 (1 250 mOsmol/kg) 条件下蔗糖显著促进巨大芽胞杆菌单独生长与混菌体系中普通生酮古龙酸菌的生长和产酸，且效果一致。在 3 L发酵罐分批发酵中添加蔗糖使2-KLG的生产强度提高了 10.4%。这一研究结果表明，添加蔗糖能够有效提高高渗条件下巨大芽胞杆菌的生长能力，促使生物活性物质的分泌，进而促进普通生酮古龙酸菌的生长和2-KLG的合成。

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Enhancing 2-keto-L-gulonic acid production under hyperosmotic stress by adding sucrose

Kejie Chen1,2, Jingwen Zhou1,2, Liming Liu1,2, Jie Liu3, Guocheng Du2, and Jian Chen1,2

1State Key Laboratory of Food Science and Technology,Jiangnan University,Wuxi214122,China
2Key Laboratory of Industrial Biotechnology,Ministry of Education,Jiangnan University,Wuxi214122,China
3Jiangsu Jiangshan Pharmaceutical Co.Ltd.,Jingjiang214500,China

Received:April 16, 2010;Accepted:July 19, 2010

Supported by:National High Technology Research and Development Program of China (863 Program) (No. 2006AA020303), Key Projects in the National Science and Technology Pillar Program during the Eleventh Five-Year Plan Period (No. 2007BAI46B02), National Basic Research Program of China(973 Program) (No. 2007CB714306), Key Program of National Natural Science Foundation of China (No. 20836003).

Corresponding author:Liming Liu. Tel: +86-510-85918307; E-mail: mingll@jiangnan.edu.cn

Jian Chen. E-mail: jchen@jiangnan.edu.cn

国家高技术研究发展计划 (863计划) (No. 2006AA020303)，“十一五”国家科技支撑计划 (No. 2007BAI46B02)，国家重点基础研究发展计划(973计划) (No. 2007CB714306)，国家自然科学基金重点项目 (No. 20836003) 资助。