hNoc4L基因重组慢病毒表达载体的构建与鉴定

王婷婷，王淑娟，严景华

1 中国科学院微生物研究所 中国科学院病原微生物与免疫学重点实验室，北京 100101

2 中国科学院研究生院，北京 100049

3 中国动物卫生与流行病学中心，青岛 266032

医学与免疫生物技术

hNoc4L基因重组慢病毒表达载体的构建与鉴定

王婷婷1,2，王淑娟3，严景华1

1 中国科学院微生物研究所 中国科学院病原微生物与免疫学重点实验室，北京 100101

2 中国科学院研究生院，北京 100049

3 中国动物卫生与流行病学中心，青岛 266032

核糖体前体的形成和核运输需要多种核仁复合物的参与，hNoc4L是酿酒酵母S. cerevisiae的核仁复合物相关蛋白4的同源蛋白，并含有保守的Noc结构域，但其功能未知。为了构建hNoc4L基因过表达的慢病毒载体，本实验通过将EF1α启动子替换原shRNA慢病毒载体pll3.7的U6启动子，成功构建了慢病毒表达载体pll3.7-EF1，并进一步得到了hNoc4L基因过表达的慢病毒载体。利用慢病毒包装系统对不同物种的细胞进行感染，以此检测该重组慢病毒载体的包装效率，并通过构建的hNoc4L过表达的RAW264.7稳定细胞系检测了该载体的免疫原性和稳定转染能力。结果表明成功构建了高效、长期稳定表达和免疫原性低的hNoc4L特异性表达的慢病毒载体，为进一步研究hNoc4L蛋白在哺乳动物核糖体生物发生中的调控作用奠定了基础。

hNoc4L基因，慢病毒表达载体，核糖体生物发生

Abstract:Formation and nuclear export of pre-ribosomes requires many nucleolar complexes. hNoc4L which contains a conserved Noc doman is a homolog of nucleolar complex associated 4 (S. cerevisiae), but its function is completely unclear. Here, we successfully got the recombinant lentiviral vector pll3.7-EF1-hNoc4L-Flag by replacing the U6 promoter in pll3.7 with EF1α promoter, and then insertedhNoc4Lto down-stream of the EF1α prompter. We determined the transduction efficiency in different mammalian cell lines based on lentiviral packaging system. Subsequently, we analyzed the immunogenicity of the recombinant lentivirus and stable expression ofhNoc4Lin RAW264.7 cells.The results showed that the recombinant lentivirus characterized a high transduction efficiency, long-term expression and low immunogenicity. Therefore, we pave the way for further identification of the biological activity of hNoc4L protein during ribosome biogenesis in mammalian.

Keywords:hNoc4Lgene, lentiviral expression system, ribosome biosynthesis

从细菌到人类所有生命的细胞中都存在着成千上万的核糖体，核糖体是蛋白质的翻译场所，负责细胞内蛋白质的合成，对细胞的生长、组织的分化和发育十分重要。细胞的大部分物质与能量都用于核糖体的合成，正在生长的细胞中，与核糖体生物发生相关的基因的转录约占整个细胞转录体系的60%以上[1]。由此可知，对核糖体生物合成的调控是细胞调控的关键步骤。目前，对于真核生物核糖体生物发生的基本过程已有初步的认识，但其中详细的机制尚不清楚，仍是一个研究热点。

在真核生物中，核糖体的生物发生是一个高度复杂和协同进行的过程，发生在不同的亚细胞器中，需要3种RNA聚合酶共同协调转录上百个基因，其中包括核仁区的 RNA聚合酶Ⅰ负责转录的pre-rRNA，细胞质中的RNA聚合酶Ⅱ负责转录的核糖体蛋白基因以及细胞核内的 RNA聚合酶Ⅲ负责转录的5S rRNA[2]。对酵母的研究发现，核糖体的生物发生主要在核仁里，后期的成熟过程是在细胞核和细胞质中进行的，主要为pre-rRNA经过多种剪切、修饰等步骤加工为成熟的 18S、5.8S和28S rRNA，与进入核仁的5S rRNA以及来自细胞质的多种相关蛋白质相结合，组装成核糖体的大小亚基的前体，再分别转运至细胞质中进一步成熟，组装成有功能的核糖体[3-4]。

在核糖体的大小亚基的组装、运输和成熟的过程中，反式调控因子发挥着十分重要的作用[5-7]，Noc(Nucleolar complex) 类蛋白复合物就是新发现的影响核糖体成熟和核运输的重要的反式调控因子。Noc类蛋白是一类核仁复合物相关蛋白，在以酵母为模式生物的研究中发现，Noc1、Noc3和Noc4均有一个由45个氨基酸组成的保守的Noc结构域[8-9]，其中Noc1-Noc2和Noc3-Noc2异源二聚体在60S核糖体前体的成熟和出核运输中发挥重要作用，而Noc4-Nop14 (Nucleolar protein 14) 异源二聚体在40S核糖体前体的成熟和核运输中发挥重要作用[9]。hNoc4L(Human nucleolar complex associated 4 homolog)，人核孔复合物蛋白4同源体，NCBI编号为Homo sapiens (mRNA，MGC3162)，其编码产物为516个氨基酸组成的多次跨膜蛋白hNoc4L，与酵母 Noc4有相同的保守的 Noc结构域，但其功能尚未有研究报道。因此本文构建了hNoc4L基因特异性表达的慢病毒载体，该重组病毒能感染小鼠成纤维细胞 NIH3T3、猴肾细胞 Marc145、小鼠巨噬细胞RAW264.7和狗肾细胞 MDCK，并得到了稳定表达hNoc4L基因的 RAW264.7细胞株，检测了重组病毒的感染效率及免疫原性，为后续研究 hNoc4L蛋白的功能奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1细胞株

人胚肾细胞293T、猴肾细胞Marc145、狗肾细胞MDCK、小鼠成纤维细胞NIH3T3和小鼠巨噬细胞系RAW264.7细胞，均为本实验室保存。

1.1.2菌种与载体

大肠杆菌 DH5α为本实验室保存，质粒pEF-BOS、pcDNA3.0-hNoc4L-Flag为本实验室保存，shRNA慢病毒载体 pll3.7、包装质粒 pLP1、pLP2和pLP/VSVG由中国科学院微生物研究所高斌研究员惠赠。pMD-18T载体购自TaKaRa公司。

1.1.3工具酶及其他

DNA聚合酶、各种限制性内切酶均购自TaKaRa公司；转染试剂PEI购自ROCHE公司，Polybrene购自INTROVIGEN公司；去内毒素超纯质粒大提试剂盒购自博大泰克生物技术公司，DNA凝胶回收纯化试剂盒购自OMEG公司，完全培养基为含10%胎牛血清 (FBS) 的DMEM培养基，为GIBCO产品；小鼠IL-6和TNF-α ELISA预包被试剂盒购自北京达科为生物技术公司。

1.2 方法

1.2.1重组质粒的构建[10]

真核表达载体 pll3.7-EF1的构建：首先，PCR获得EF1α启动子全序列，即以pEF-BOS为模板，以 F1、R1为引物扩增 EF1α启动子全序列。PCR反应参数：94℃预变性5 min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸2 min，30个循环；72℃延伸10 min，16℃保温5 min。用1%琼脂糖凝胶电泳鉴定并分离产物，应用OMEG公司的DNA凝胶回收试剂盒回收并纯化EF1α启动子片段，目的片段大小约1 200 bp。用T4 DNA连接酶将目的片段连接到pMD-18T载体上并转入DH5α感受态细胞，挑取克隆进行菌液PCR和双酶切鉴定正确后，进行测序。用XbaI和XhoI对质粒pll3.7双酶切以切除U6启动子，凝胶电泳回收纯化pll3.7的片段。酶切后pll3.7的大小约为 7 100 bp。同样的方法对质粒 pMD-18T-EF1α进行双酶切，回收EF1α片段。将两者用T4 DNA连接酶连接，对所得克隆进行菌液PCR和双酶切鉴定，获得重组质粒pll3.7-EF1，构建结构图见图 1。所用引物如下(5′−3′)：F1: GCTCTAGAC GTGAGGCTCCGGTGCCCGTC；R1: CCGCTCGAG TCACGACACCTGAAATGGAA。

重组表达载体pll3.7-EF1-hNoc4L-Flag的构建：用XhoI和NotI对质粒 pll3.7-EF1和 pcDNA3.0-hNoc4L-Flag进行双酶切，DNA凝胶电泳回收纯化pll3.7-EF1和hNoc4-Flag-His的片段。将两者用T4 DNA连接酶连接转入DH5α感受态细胞，对所得克隆进行菌液 PCR和双酶切鉴定，获得重组质粒pll3.7-EF1-hNoc4L-Flag。

图1 重组质粒载体的构建示意图Fig.1 Construction of recombinant plasmids. A: EF-1α; B: pll3.7-U6; C: hNoc4L-Flag-his.

1.2.2重组慢病毒的包装

重组表达型慢病毒载体pll3.7-EF1-hNoc4L-Flag、包装质粒pLP1、pLP2和pLP/VSVG分别用试剂盒进行超纯去内毒素大量提取，利用 PEI法共转染HEK 293T细胞。转染主要步骤 (以10 cm培养皿为例)：将 18 μg质粒 (载体和包装质粒各 4.5 μg) 和144 μg PEI分别溶于生理盐水中，使其终体积均为200 μL，混匀；静置5 min后，将两者混合，再静置20 min，将质粒-PEI混合物逐滴加入到细胞培养皿中，4～6 h后更换新鲜的完全培养基 (DMEM+ 10%FBS，下同)。转染 24 h后，在倒置荧光显微镜下观察细胞的绿色荧光蛋白的表达情况，确认转染成功后，收集48～72 h病毒上清。3 000 r/min低速离心15 min去除细胞碎片，短期4℃保存备用，长期保存则1 mL分装，于−80℃保存。

1.2.3重组病毒感染不同来源的细胞

将293T细胞接种于6孔板中，以培养24 h后细胞密度达到 30%～40%为宜。移去培养基，加入收集的病毒上清1 mL，补加1 mL新鲜的完全培养基，并加入Polybrene，使其终浓度为8 μg/mL，感染8 h后，更换为新鲜的完全培养基。感染48 h后荧光显微镜下观察是否可见绿色荧光。病毒成功包装后，同样方法分别感染Marc145、MDCK、NIH3T3和RAW264.7细胞，并于48 h后观察感染情况。

1.2.4过表达hNoc4L的RAW264.7稳定细胞株的构建

将假病毒感染的 RAW264.7细胞通过流式细胞仪进行分选，得到hNoc4L基因过表达的多克隆细胞。将得到的阳性细胞进行培养，并检测静息状态下的不同 RAW264.7细胞株的细胞因子分泌情况，具体检测方法见1.2.5。培养30 d后，在荧光显微镜下观察稳定细胞株的阳性情况，并通过 Western blotting检测hNoc4L基因的表达情况。

1.2.5ELISA法检测RAW264.7稳定克隆株的细胞因子IL-6和TNF-α的分泌

本过程中使用的是达科为生物技术有限公司自主研发的ELISA预包被减步法试剂盒，原理为双抗体夹心法。步骤为：将104个细胞接种于48孔板，每种细胞设置3个重复。培养8 h后收集细胞上清，按照试剂盒的要求进行操作。以试剂盒配备的标准品制作标准曲线 (0 pg/mL、31.25 pg/mL、62.5 pg/mL、125 pg/mL、250 pg/mL和500 pg/mL)。通过标准曲线计算细胞上清中 IL-6和 TNF-α的含量。以加入100 ng/mL LPS刺激的RAW264.7细胞作阳性对照。

1.2.6Western blotting检测目的基因hNoc4L的表达情况

用裂解缓冲液 (0.5% NP-40的PBS，含蛋白酶抑制剂混合物) 裂解细胞，离心取上清，加入上样缓冲液 (含DTT)，100℃处理5 min；各取15 μL上样进行 SDS-PAGE 电泳 (80 V，30 min；120 V，1 h)；转膜 (200 mA，1 h)；含5%脱脂奶粉的TBS封闭1 h，加入含有anti-Flag (1∶1 000) 的封闭液摇动1～2 h；用 TBST (含0.5‰ Tween-20) 洗 3次；用含有IgG-HRP (1∶5 000) 的封闭液摇动1 h；用TBST洗3次；将膜晾干，加显色液于膜上，用封口膜将膜包住放入暗盒内，加入X光胶片，进行曝光、显影和定影。

2 结果

2.1 真核表达载体pll3.7-EF1以及hNoc4L基因特异性表达的重组慢病毒载体的构建与表达：

以pEF-BOS为模板，将PCR扩增出的EF1α片段插入到pMD-18T载体上，双酶切得到的阳性克隆质粒，回收目的片段，在将其插入到 pll3.7载体的XbaI和XhoI之间，所挑取的克隆经XbaI和XhoI双酶切鉴定，切出约1 184 bp的条带，构建的慢病毒表达载体pll3.7-EF1经测序鉴定正确。以pcDNA3.0-hNoc4L-Flag为模板酶切出的hNoc4L-Flag-his6片段插入到pll3.7-EF1α的XbaI和XhoI之间，所挑的阳性克隆经酶切得到约1 592 bp的片段，与目的片段大小相符，且测序正确。由于pll3.7-EF1-hNoc4LFlag包含有由CMV启动子启动的GFP基因，因此，可以通过荧光显微镜观察重组质粒的转染效率及重组病毒的感染效率。将构建成功的载体用PEI法瞬时转染293T细胞，24 h后，在荧光显微镜下能观察到大部分细胞都被成功转染重组质粒，收集已成功转染的293T细胞，并通过Western blotting检测到hNoc4L基因的成功表达(图2)。

图2 重组质粒载体的构建与表达鉴定Fig.2 The construction and expression of recombinant plasmids. (A) Double digestion of recombinant plasmids pll3.7-EF1 (M1:marker DL2000; M2: marker 1 kb DNA ladder; 1−5: five repeats). (B) pll3.7-EF1-hNoc4L-Flag (M1: marker DL2000; M2: marker 1 kb DNA ladder; 1−3: three repeats). (C) Transfecting pll3.7-EF1-hNOC4L-Flag in 293T cells. (D) Western blotting analyze ofhNOC4Lgene (lane 1: pll3.7-EF1 in 293T cells; lane 2: pll3.7-EF1-hNoc4L-Flag in 293T cells).

2.2 重组慢病毒的包装及鉴定

将重组表达型慢病毒载体 pll3.7-EF1-hNoc4LFlag和病毒包装质粒pLP1、pLP2和pLP/VSVG共转染293T细胞，24 h后可观察到绿色荧光蛋白的表达，且转染效率较高 (数据未显示)。继续培养细胞，72 h后收集病毒上清，并感染293T细胞，将已感染的细胞培养48 h后在倒置荧光显微镜下可观察到绿色荧光，说明重组慢病毒已成功生产 (图 3)。将同一视野自然光和荧光下的图片进行比对发现，重组慢病毒载体可以高效感染293T细胞。

图3 重组慢病毒对不同细胞的感染后观察EGFP的表达Fig.3 EGFP expression after transducing recombinant lentiviral construct into the mammalian cell lines of choice under light microscope and fluorescence microscope.

2.3 慢病毒假病毒对不同细胞的感染结果

近年来，一些研究表明，索氏的“语言”实际上是科学主义的产物[20-21]。所谓科学主义，是指主张把自然科学的方法应用于人文社会科学在内的一切研究领域的观点。科学研究往往需要去除各种“杂质”的影响，索绪尔的语言学理论中含有科学主义的因素，他提出的变革方法就是要开展一场“同质化”运动”[22]364。这里我们有必要深究两个问题：(1)社会科学为什么要去除杂质，开展同质化运动？(2)社会科学是如何去除杂质，达到同质化这一目的的？

为了进一步检验重组慢病毒表达载体对不同细胞的感染情况，用收集的病毒分别感染 4种不同物种来源的细胞系：猴肾细胞 Marc145、狗肾细胞MDCK、小鼠成纤维细胞 NIH3T3和小鼠巨噬细胞RAW264.7。感染 48 h后倒置荧光显微镜下观察发现这 4种细胞均可见绿色荧光 (图 3)，说明包装出的慢病毒能成功感染目标细胞，其中 Marc145、MDCK及 NIH3T3细胞有较高的感染效率，而RAW264.7细胞感染效率较低。

2.4 过表达hNoc4L基因的 RAW264.7稳定细胞系的构建以及细胞特性的鉴定

感染重组病毒的RAW264.7细胞经过3周的培养后，通过流式细胞仪分选，得到了hNoc4L基因过表达的稳定细胞系 (图4)。RAW264.7细胞是小鼠巨噬细胞系，有外界刺激时会释放大量的炎症因子。为了了解病毒感染 RAW264.7细胞是否会引起细胞强烈的免疫原性，我们用ELISA法检测了RAW264.7细胞及 hNoc4L过表达的稳定细胞系静息状态的细胞因子IL-6和TNF-α的分泌情况 (表1)。结果显示，与没有感染病毒的RAW264.7细胞相比，重组慢病毒感染的 RAW264.7细胞 (包括 RAW264.7-pll3.7-EF1及 RAW264.7-pll3.7-EF1-hNoc4L-Flag) 的 TNF-α 和IL-6的含量都没有升高，表明构建的重组病毒没有引起 RAW264.7细胞发生明显的免疫反应。为了检测hNoc4L基因在细胞中的持续表达情况，我们将上述细胞株连续培养30 d后收集该细胞，用Flag抗体检测hNoc4L蛋白的表达，在约57 kDa大小处检测到特征带，符合预期大小，说明hNoc4L基因成功地稳定表达 (图 5)。用荧光显微镜观察，同一视野自然光和荧光对比发现细胞的阳性率无明显改变 (数据未显示)。

图4 稳定表达hNoc4L基因的RAW264.7细胞系Fig.4 Stable expression ofhNoc4Lgene in RAW264.7 cell line.

表1 ELISA检测 RAW264.7和hNoc4L稳定细胞系的IL-6和TNF-α分泌情况Table 1 Determination of IL-6 and TNF-α of different cell lines by ELISA

图5 Western blotting检测稳定细胞系中hNoc4L基因的表达Fig.5 Western blotting assay ofhNoc4Lgene in stable cell lines of RAW264.7. 1: pll3.7-EF1 in RAW264.7 cells; 2:pll3.7-EF1- hNoc4L-Flag in RAW264.7 cells.

3 讨论

细胞生长和繁殖的快慢取决于细胞内蛋白质合成的速率，而蛋白质合成的速率又取决于核糖体的生成和核糖体RNA基因的转录速率，由此可知，核糖体的生物合成对细胞的生长有着决定性的作用。核糖体的生物合成是一个极其复杂的过程，在基因结构水平上，核糖体RNA基因通常以多拷贝的形式存在于染色体上形成串联重复单位序列，这些序列上还包含了一些重要的顺式调控元件，配合着一些反式调控因子调控核糖体RNA基因的转录；在核糖体的大小亚基的成熟过程中，反式作用因子也发挥着重要的作用，如核酸酶对pre-rRNA非编码序列的切除、SnoRNP对35S pre-RNA的假尿嘧啶化和甲基化修饰、RNA螺旋酶和RNA分子伴侣介导的RNP折叠和改构、GTPase和 ATPase催化的蛋白质的聚合和解聚合过程等[7,11-13]。在以酵母为模式生物对核糖体生物发生的调控机制进行研究的过程中不断有新的发现。在酿酒酵母S. cerevisiae中，Noc类蛋白复合物是一类影响核糖体大小亚基装配和核运输的重要的反式调控因子，但其在哺乳动物中的功能未知。因此研究Noc类蛋白在哺乳动物的核糖体生物合成中的作用是十分重要的，本实验选择了hNoc4L蛋白为研究对象。

在实验研究中，常用的病毒载体有腺病毒、逆转录病毒和慢病毒载体等。腺病毒可以携带大DNA片段并能转染多种细胞，但转染效率较低，有较高的抗原性和毒性，只能短暂表达目的蛋白[14]；而慢病毒属于逆转录病毒的一种，基于 HIV-I型病毒构建的慢病毒载体可以高效感染处于分裂期和非分裂期的细胞，能够携带大片段基因，且不易诱发宿主免疫反应，更重要的是能将目的基因高效整合到宿主细胞染色体中，不易引起插入突变，理论上能够在细胞内永久表达并在子代中稳定表达[15]，而且改造后的慢病毒假病毒没有复制能力，具有较好的生物安全性，是一种理想的基因转移载体[16]。因此，本研究选择慢病毒载体作为特异性表达hNoc4L基因的载体。

慢病毒载体的另一个优点是有广泛的细胞感染谱，为了检测我们所获得的重组慢病毒载体的感染效果，我们感染了不同来源的细胞株，发现其能高效感染来源于人、鼠、犬等不同物种的细胞系。MDCK细胞和Marc145细胞的常规转染效率不高，约在5%～20%之间；而利用本实验中构建的载体，可以达到70%以上的阳性率，因此使用该载体可以方便地解决不易转染的细胞系的外源基因难以高效导入的问题。

RAW264.7细胞是小鼠的巨噬细胞，当有外界刺激时，该细胞极易分化，外形由正常状态下的圆球形向不规则的形状转变，并且伴随有炎症因子的释放，所以可以用来检测我们所构建的hNoc4L基因特异性表达载体的免疫原性。实验数据表明，该载体通过感染进入细胞后，并没有引起细胞形状的改变，也没有造成强烈的免疫反应。此外，RAW264.7细胞也是一种极难利用常规化学试剂转染的细胞，常用的方法就是电转，而电转是瞬时转染，成本高，转化后的细胞又容易分化。我们所获得的hNoc4L基因特异性表达的载体因其带有EGFP标签，可以通过 FACS分选得到阳性细胞，又加之慢病毒载体可以通过本身具有的5′LTR和3′LTR稳定整合到细胞基因组中并长期表达，因此免去使用抗生素筛选稳定克隆所需的较长的时间周期。实验结果也表明，我们所获得的稳定细胞系能够长期稳定表达hNoc4L基因。

综上所述，本研究成功构建了hNoc4L基因特异性表达的重组慢病毒载体，该载体具有高效、长期稳定表达和免疫原性低的特点，为后续研究hNoc4L蛋白在哺乳动物核糖体生物发生中的调控作用奠定了基础。

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Construction and identification of recombinant lentiviral vector ofhNoc4Lgene

Tingting Wang1,2, Shujuan Wang3, and Jinghua Yan1

1CAS Key Laboratory of Pathogenic Microbiology and Immunology,Institute of Microbiology,Chinese Academy of Science,Beijing100101,China
2Graduate University of Chinese Academy of Sciences,Beijing100049,China
3China Animal Health and Epidemiology Center,Qingdao266032,China

Received:April 23, 2010;Accepted:May 11, 2010

Supported by:National Natural Science Foundation of China (No. 30870118).

Corresponding author:Jinghua Yan. Tel: +86-10-64807569; Fax: +86-10-64807598; E-mail: yanjh@im.ac.cn

国家自然科学基金项目 (No. 30870118) 资助。