小眼虫藻Δ8-脂肪酸脱氢酶基因的克隆及其在酿酒酵母中的表达

黎明，欧秀元，杨向东，郭东全，钱雪艳，邢来君，魏东盛，李明春

1 南开大学微生物学系 分子微生物学与技术教育部重点实验室，天津 300071

2 天津科技大学生物工程学院 工业微生物教育部重点实验室，天津 300457

3 吉林省农业科学院生物技术研究中心，长春 130033

工业生物技术

小眼虫藻Δ8-脂肪酸脱氢酶基因的克隆及其在酿酒酵母中的表达

黎明1,2，欧秀元1，杨向东3，郭东全3，钱雪艳3，邢来君1，魏东盛1，李明春1

1 南开大学微生物学系 分子微生物学与技术教育部重点实验室，天津 300071

2 天津科技大学生物工程学院 工业微生物教育部重点实验室，天津 300457

3 吉林省农业科学院生物技术研究中心，长春 130033

Δ8途径是合成多不饱和脂肪酸的替代途径，Δ8-脂肪酸脱氢酶是该途径的关键酶之一。根据已报道的Δ8-脂肪酸脱氢酶基因设计引物，分别从小眼虫藻基因组DNA和cDNA中扩增得到该基因片段，序列分析表明：结构基因长1 266 bp，编码421个氨基酸；该基因没有内含子，比已经报道的Δ8-脂肪酸脱氢酶基因长6 bp，并且N末端序列也有所不同。利用酿酒酵母的载体pYES2.0构建Δ8-脂肪酸脱氢酶表达载体pYEFD，并转化到营养缺陷型酿酒酵母菌株INVSc1中，在选择培养基中筛选得到酿酒酵母转化菌株YD8。YD8在合适的培养条件下，添加外源底物二十碳二烯酸和二十碳三烯酸并诱导基因表达。脂肪酸甲酯气相色谱分析表明小眼虫藻Δ8-脂肪酸脱氢酶基因在酿酒酵母中获得了高效表达，将二十碳二烯酸和二十碳三烯酸分别转化成二高-γ-亚麻酸和二十碳四烯酸，其底物转化率分别达到了31.2%和46.3%。

Δ8-脂肪酸脱氢酶，小眼虫藻，多不饱和脂肪酸

Abstract:Δ8desaturase pathway, different from common Δ6desaturase pathway, is an alternate pathway of polyunsaturated fatty acids biosynthesis. Δ8-fatty acid desaturase is one of the key enzymes in Δ8desaturase pathway. Two specific fragments were separately cloned from genomic DNA and cDNA ofEuglena gracilisby PCR with the primers designed according to the reportedsequence. Comparison of the genomic and cDNA sequences revealed that there wasn’t intron in this Δ -fatty acid desaturase gene.This gene has an open reading frame of 1 266 bp that encodes 421 amino acids. It is 6 bp longer than the reported gene sequence, and also showed certain difference from the reported sequence in the N-terminal. The recombinant expression plasmid pYEFD by subcloning Δ8-fatty acid desaturase gene into the yeast-E. colishuttle vector pYES2.0 was constructed and was transformed into the defective mutant INVSc1 ofSaccharomyces cerevisiaeby electrotransformation. The resulting strain YD8 harboring plasmid pYEFD was selected and was cultured in the induction medium with exogenous substrates ω6-eicosadienoic acid and ω3-eicosatrienoic acid for the expression of Δ8-fatty acid desaturase gene. The results indicated that high level expressed Δ8-fatty acid desaturase could convert ω6-eicosadienoic acid and ω3-eicosatrienoic acid to dihomo-γ-linolenic acid and eicosatetraenoic acid with substrate conversion ratio 31.2% and 46.3%, respectively.

Keywords:Δ8-fatty acid desaturase,Euglena gracilis, polyunsaturated fatty acids

多不饱和脂肪酸 (Polyunsaturated fatty acid，PUFAs) 是指含有2个或2个以上顺式双键、碳原子数为 16至 22的直链脂肪酸[1]。主要包括 γ-亚麻酸(γ-linolenic acid，GLA)、二高-γ-亚麻酸(Dihomo-γlinolenic acid，DGLA)、花生四烯酸 (Arachidonic acid，ARA)、二十碳五烯酸 (Eicosapentaenoic acid，EPA)、二十二碳六烯酸 (Docosahexaenoic acid，DHA) 等。多不饱和脂肪酸是以多种形式存在于细胞中，如细胞膜、储存脂、甘油三酯磷脂、鞘脂和脂蛋白等。作为生物膜结构中磷脂的重要成分之一，PUFAs的种类、数量、饱和度的改变会直接影响生物膜的刚性结构，因此影响了与刚性结构相关的各种生理功能。经过研究发现PUFAs与包括心血管疾病、糖尿病、关节炎、牛皮癣、溃疡性结肠炎在内的多种慢性疾病相关，并且可以通过影响细胞的增殖和信号传导途径来影响癌症的发生和发展情况[2-4]。最近的研究表明，PUFAs还能影响骨骼的生长与修复过程。不仅如此，PUFAs还能作为一种重要的生理活性物质影响胎儿的发育[5]。因此PUFAs的生物合成以及合成途径中的一些关键酶受到广泛的关注。

图1 多不饱和脂肪酸的合成途径Fig.1 Pathways of polyunsaturated fatty acid synthsis. The common Δ6pathway is indicated by solid arrows and the alternate Δ8pathway is indicated by hollow arrows. Des: desaturase; elo: elongase; SA: Stearic acid; OA: Oleic acid; LA: Linoleic acid; ALA:α-linolenic acid; STA: stearidonic acid; ETA: eicosatetraenoic acid; EDA: ω6-eicosadienoic acid; EtrA: ω3-eicosatrienoic acid; ETA:eicosatetraenoic acid; GLA: γ-linolenic acid; DGLA: dihomo-γ-linolenic acid: ARA: arachidonic acid; EPA: eicosapentaenoic acid.

多不饱和脂肪酸的代谢从硬脂酸 (Stearic acid，SA) 开始，经过一系列的脱氢和延长反应，形成各种不同的PUFAs，主要包括经典的Δ6合成途径和替代的Δ8合成途径 (图1)。Δ6合成途径广泛存在于微生物中，其关键酶 Δ6脱氢酶和 Δ6延长酶及其基因已经被广泛克隆和研究。Δ8合成途径主要存在于一些藻类微生物，其关键酶基因 Δ8脱氢酶基因和 Δ9延长酶基因首先被Wallis等[6]和Qia等[7]分别从小眼虫藻和球等鞭金藻中克隆出来，并在酿酒酵母中进行了功能验证。Fraser等[8]用这2个基因在转基因拟南芥植物中重构了Δ8合成途径并且合成了ARA和EPA。但是，其他关于Δ8脱氢酶基因和Δ9延长酶基因的报道却很少。

ARA和EPA等人体必需的PUFAs在植物油中含量极低，主要从深海鱼油中提取。由于资源匮乏，而且受季节、产地等因素的影响，鱼油中的ARA、EPA等含量低且不稳定，产品已经不能满足市场需求。虽然一些藻类的多不饱和脂肪酸 (PUFAs) 含量高[9]，但生物量低，培养条件对多不饱和脂肪酸的产量影响较大，产业化前景暗淡。大豆是我国主要的油料作物，如果能在大豆种子中合成 ARA和EPA，可以提高大豆油的品质。Δ8-脂肪酸脱氢酶基因的克隆及其在酿酒酵母中的表达，不仅为生产含ARA和EPA的转基因大豆奠定基础；同时，不同Δ8-脂肪酸脱氢酶基因的克隆为研究多不饱和脂肪酸脱氢酶系的进化关系提供了新的信息。

1 材料与方法

1.1 藻种、菌种和载体

小眼虫藻Euglena gracilisFH277购自中国科学院水生生物研究所淡水藻种库；大肠杆菌Escherichia coliDH5α由本实验室保存；pGEM-T easy载体试剂盒购自 Promega公司；表达载体pYES2.0和酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae营养缺陷型INVSc1 (MATa his3Δ1 leu2 trp1-289 ura3-52/MATα his3Δ1 leu2 trp1-289 ura3-52) 购自 Invitrogen公司。

1.2 酶及试剂

限制酶BamH I、NotI、T4 DNA 连接酶、X-gal、IPTG购自宝生物工程有限公司；逆转录酶购自Promega公司；EDA、EtrA、DGLA和ETA标准品购自 Cayman chemical公司；NP-40、CTAB购自Sigma公司；DNA片段快速纯化/回收试剂盒、氨苄青霉素和DNA marker III购自北京鼎国生物技术有限责任公司；TRNzol总RNA提取试剂购自天根生化科技 (北京) 有限公司；其他常规试剂均为国产分析纯。

1.3 培养基

LB培养基和YPD培养基参见文献[10]，酵母营养缺陷型选择 SC-Ura培养基和诱导表达培养基的配制按照Invitrogen公司操作手册进行。小眼虫藻养殖使用HUT培养基[6]。

1.4 引物设计、合成与序列测序

引物 (表1) 合成和序列测定均由上海生工完成。

表1 本研究所用引物Table 1 Primers used in this study

为了克隆Δ8-脂肪酸脱氢酶基因，根据已经报道的小眼虫藻 Δ8-脂肪酸脱氢酶基因序列 (GenBank Accession No. AF139720) 设计引物 TEFDF、TEFDR，引物没有引入限制性酶切位点。为了构建表达载体pYEFD，根据克隆测序的EFD基因序列以及酿酒酵母表达载体pYES2.0的多克隆位点设计引物YEFDF、YEFDR，并分别被引入限制性酶切位点BamH I和XhoI (下划线部分)。同时，为了能够准确识别翻译起始密码子和提高翻译效率，在起始密码子上游加入了酵母一致序列GCCACC。

1.5 小眼虫藻Δ8-脂肪酸脱氢酶基因的克隆

将小眼虫藻接种到150 mLHUT培养基中，22℃培养3 d，每天光照12 h，摇动1～2次。5 000 r/min离心收集藻体，分别用TRNzol法提取小眼虫藻的总RNA和 CTAB法提取小眼虫藻的基因组 DNA。按照Promega公司的逆转录酶说明书，以小眼虫藻总RNA为模板，以TEFDR为引物合成cDNA，冻存于−20℃备用。

以TEFDF和TEFDR为引物，以小眼虫藻基因组和总cDNA为模板分别进行PCR扩增。PCR扩增条件为：94℃预变性5 min；然后94℃变性40s，55℃退火30s，72℃延伸1.5 min，30个循环；最后72℃延伸10 min。扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，目的片段用凝胶回收试剂盒回收，然后连接到pGME-T easy载体，转化大肠杆菌DH5α，先通过菌落PCR筛选阳性克隆，然后将阳性克隆提质粒进行酶切验证，最后将验证正确的质粒送上海生工测序。重复3次。

1.6 表达载体的构建、转化与Δ8-脂肪酸脱氢酶基因的诱导表达

以测序正确Δ8-脂肪酸脱氢酶基因ORF为模板，以YEFDF、YEFDR为引物进行PCR扩增，PCR产物和表达载体pYES2.0分别用BamH I和XhoI双酶切，将目的片段回收之后连接，并转化到大肠杆菌DH5α中，大肠杆菌感受态准备和转化方法参考文献[10]。筛选转化子，经过PCR和酶切检测，得到重组质粒pYEFD。将质粒pYES2.0和pYEFD电击转化到营养缺陷型酿酒酵母INVSc1中，在SC-Ura 培养基上筛选得到转化子，分别作为对照菌株和工程菌株YD8。酿酒酵母电击转化方法和质粒提取方法参考文献[11]。

将对照菌株和工程菌株YD8接种到100 mL三角瓶装有15 mL的SC-Ura的液体培养基中，在30℃和180 r/min条件下过夜培养，将过夜培养物接种到250 mL三角瓶装有50 mL含有1% NP40和2%的半乳糖的SC-Ura诱导培养基中，使OD600达到0.4，同时在培养基中添加终浓度为0.1 mol/L的底物EDA和EtrA。22℃和180 r/min条件下诱导培养72 h，收获菌体。

1.7 脂肪酸提取及甲酯化

将收获的菌体用去离子水洗涤 3次，50℃烘干10 h后，磨碎。加入5% KOH-CH3OH溶液，70℃反应2 h，之后加入14% BF3-CH3OH，70℃反应1 h，合成脂肪酸甲酯。利用1∶4的氯仿：正己烷萃取脂肪酸甲酯，用氮气吹干，正己烷回溶，备用待测。

1.8 脂肪酸甲酯的气相色谱分析

气相色谱分析采用弹性石英毛细管柱，载气为N2，线速8 cm/s。分流比100:1，气化温度280℃，柱温240℃，尾吹32 mL/min，检测器为氢火焰离子化检测器，上样量2 µL。

1.9 转化率的计算方法

转化率=产物所占总脂肪酸的含量/(产物所占总脂肪酸的含量+底物所占总脂肪酸的含量)×100%。重复试验3次，求平均值。

2 结果

2.1 Δ8-脂肪酸脱氢酶基因克隆与序列分析

提取小眼虫藻的总RNA，并以TEFDR为引物反转录得到 cDNA，再提取小眼虫藻的基因组，分别以 cDNA和基因组 DNA为模板，以 TEFDF和TEFDR为引物进行 PCR扩增，都得到了约1.2 kb的片段 (图2)。将2个片段分别连接到pGEM-T easy载体上构建成载体pTEFD和pTEFDm，转化大肠杆菌DH5α，筛选阳性克隆并测序。测序结果表明：2种方式克隆的片段均为 1 266 bp，是一个完整的ORF，共编码 421个氨基酸；同时还发现，该基因没有内含子。该基因序列已经提交到 GenBank(Accession No. GU812432)。已经报道的小眼虫藻Δ8-脂肪酸脱氢酶基因序列 (GenBank Accession No.AF139720) 所编码的脱氢酶被定义为 EFD1，所以将我们克隆的小眼虫藻 Δ8-脂肪酸脱氢酶基因序列所编码的脱氢酶定义为EFD2。

图2 PCR产物电泳图Fig.2 Electrophoresis analysis of PCR product. M: DNA marker Ⅲ; 1: cDNA PCR; 2: genome DNA PCR.

efd1基因为1 260 bp，编码419个氨基酸，比efd2短6 bp、2个氨基酸。利用软件DNAMAN对efd1和efd2进行比较，两者核苷酸相似性98.5%，氨基酸相似性 96.4%。由图 3可以看出，EFD1和EFD2的主要区别在于 N端氨基酸残基不同，后面虽然也有 6个氨基酸残基不一样，但是，3个典型的组氨酸模体 (Motif) HXXXHH、HXXHH和QXXHH和一个细胞色素 b5样的结构域却没有改变，具有典型的脂肪酸脱氢酶的结构特征。

2.2 表达载体pYEFD的构建与鉴定

将以载体pTEFD为模板，以YEFDF、YEFDR为引物进行PCR扩增的产物和载体pYES2.0分别用BamH I和XhoI双酶切，回收连接之后，转化到大肠杆菌DH5α中，从含有Amp的LB平板上随机挑选转化子，小量提取质粒，分别通过PCR和酶切验证 (图4)，最后将验证正确的质粒送上海生工测序，序列与阅读框架正确，表明表达载体 pYEFD构建成功。

图3 EFD1和EFD2氨基酸序列比较Fig.3 Alignment of amino acid sequences of EFD1 and EFD2.

2.3 Δ8-脂肪酸脱氢酶基因诱导表达

将空载体pYES2.0和表达载体pYEFD电击转化到酿酒酵母缺陷型INVSc1中，在SC-Ura平板上筛选到转化空载体的对照菌株和转化 pYEFD的工程菌株YD8。对照菌株和工程菌株先接种在碳源为蔗糖的SC-Ura培养基中培养过夜，然后转接到碳源为半乳糖并添加有底物 EDA和 EtrA诱导培养基中22℃培养72 h，收集菌体，提取脂肪酸并甲酯化后进行气相色谱分析，结果如图5所示。图5A标准品 EDA、DGLA、EtrA和 ETA，出峰时间分别为21.337 min、22.301 min、23.544 min 和 24.669 min。图5B为转化了空载体 pYES2.0的对照菌株，由于加入了底物EDA和EtrA，所以在相应时间点出现了底物峰。图5C为转化了pYEFD的工程菌株YD8。与图5B对比，除了相应位置的底物峰而外，还出现了DGLA和ETA的产物峰。说明EDA经过Δ8脱氢转变成DGLA，EtrA经过Δ8脱氢转变成ETA，也说明克隆的EFD2基因产物具有位置专一的Δ8-脂肪酸脱氢酶活性。经过3次重复试验进行计算，转化菌株YD8中的DGLA和ETA分别占总脂肪酸含量的8.32%和9.24%，底物EDA和EtrA转化率分别达到了31.2%和46.3%。

图4 重组质粒pYEFD的鉴定Fig.4 Identification of recombinant plasmid pYEFD. 1: PCR product of pYEFD; 2: pYES2.0 digested withBamH I andXhoI; 3: pYEFD digested with byBamH I andXhoI; 4: DNA marker Ⅲ.

图5 酿酒酵母总脂肪酸气相色谱分析图Fig.5 GC analysis of fatty acid methyl esters of total lipids ofS. cerevisiaegrown under inducing conditions. (A) Standard of EDA, DGLA, EtrA and ETA. (B) INVSc1 transformed with pYES2.0. (C) INVSc1 transformed with pYPTD5.

3 讨论

Δ8途径和 Δ6途径的主要区别是 Δ8途径是先经过 Δ9-延长酶催化延长 2个碳原子后再在 Δ8位脱氢形成 20碳的多不饱和脂肪酸，因此 Δ8途径的关键酶是Δ9-延长酶和Δ8-脱氢酶；Δ6途径是先在Δ6位脱氢后再经过 Δ6-延长酶催化延长 2个碳原子形成 20碳的多不饱和脂肪酸，因此 Δ6-脱氢酶催化 Δ6位脱氢是该途径的限速步骤。小眼虫藻是单细胞的裸藻，由于缺乏 Δ6-脱氢酶，是通过 Δ8途径合成并积累大量的多不饱和脂肪酸。目前，Δ8途径主要存在于原生动物Tetrahymena pyriformis、变形虫Acanthamoebasp.、眼虫藻和金藻。但是目前只有眼虫藻Δ8-脱氢酶基因已被克隆，因此，新的Δ8-脱氢酶基因的克隆为研究多不饱和脂肪酸脱氢酶系的进化关系提供了新的信息。

所有鉴定的脂肪酸脱氢酶都有几个短且高度保守的区域：即3个组氨酸模体HXXXHH、HXXHH和 HXXHH，这 3个组氨酸模体及其相对位置对于酶活性是必需的。Δ5-和Δ6-脱氢酶的N-末端还有一个细胞色素b5样的结构域，这时脱氢酶的第3个组氨酸模体就变成QXXHH[12]。我们克隆的Δ8-脱氢酶N-末端包含一个细胞色素 b5样的结构域和改变了的第3个组氨酸模体QXXHH，说明Δ8-脱氢酶在结构上是和Δ5-和Δ6-脱氢酶一致的。我们进行了3次重复实验，克隆的 Δ8-脱氢酶基因的氨基酸序列与文献报道的 Δ8-脱氢酶基因的氨基酸序列相似性为96.4%，其组氨酸模体和细胞色素b5样结构域完全一致，主要是细胞色素 b5样结构域之前的 N-末端序列不同。我们还试图从小眼虫藻FH849和FH850(均购自中国科学院水生生物研究所淡水藻种库) 中克隆Δ8-脱氢酶基因，无论是以基因的5′和3′末端还是以保守区域组氨酸模体和/或细胞色素 b5样结构域设计引物，都没有克隆出Δ8-脱氢酶基因 (数据未显示)，这说明，不同小眼虫藻的Δ8-脱氢酶基因序列不同，甚至相差很大，而且，Δ8-脱氢酶基因序列可能还反映出不同小眼虫藻的进化及亲缘关系的远近。

由于酿酒酵母缺乏内源的多不饱和脂肪酸，因此酿酒酵母成为鉴定多不饱和脂肪酸脱氢酶和延长酶活性及其底物专一性的理想宿主[6-7,13]。当我们在培养基中添加底物EDA和EtrA诱导酿酒酵母工程菌YD8表达EFD2时，有产物DGLA和ETA生成，由于工程菌缺乏内源的DGLA和ETA，说明是EDA经过Δ8脱氢转变成DGLA，EtrA经过Δ8脱氢转变成ETA，说明EFD2基因产物具有Δ8-脂肪酸脱氢酶活性；同样，当我们在培养基中添加底物LA和ALA诱导酿酒酵母工程菌YD8表达EFD2时，却没有新的产物生成 (数据未显示)，说明 EFD2基因产物具有位置专一的Δ8-脂肪酸脱氢酶活性。

Δ8-脂肪酸脱氢酶克隆对于用 Δ8途径生产多不饱和脂肪酸具有重要意义。已经有研究者将该途径引入到拟南芥中并且成功合成了ARA和EPA[8]。大豆是我国最主要的油料作物，含有丰富的Δ8途径底物LA和ALA，如果在大豆中重构Δ8途径，就可以在大豆种子中合成 ARA和 EPA，提高大豆油的品质。本实验室已经克隆了大豆种子特异性启动子BCSP952[14]、Δ9-脂肪酸延长酶 ASE2 (结果另文发表) 基因和 Δ5-脂肪酸脱氢酶基因[15]，为大量合成ARA和EPA的转基因大豆提供了参考。

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Cloning of Δ8-fatty acid desaturase gene fromEuglena gracilisand its expression inSaccharomyces cerevisiae

Ming Li1,2, Xiuyuan Ou1, Dongsheng Wei1, Xiangdong Yang3, Dongquan Guo3, Xueyan Qian3,Laijun Xing1, and Mingchun Li1

1Key Laboratory of Molecular Microbiology and Technology,Ministry of Education,Department of Microbiology,Nankai University,Tianjin
300071,China
2Key Laboratory of Industrial Microbiology,Ministry of Education,School of Bioengineering,Tianjin University of Science and Technology,Tianjin300457,China
3Biotechnology Research Center,Jilin Academy of Agriculture Sciences,Changchun130033,China

Received:February 8, 2010;Accepted:May 17, 2010

Supported by:National Natural Science Foundation of China (No. 30771355), National High Technology Research and Development Program of China (863 Program) (No. 2007AA10Z189), Research Fund for the New Teacher Doctoral Programe of Ministry of Education of China (No.20070055061).

Corresponding author:Mingchun Li. Tel: +86-22-23508506; Fax: +86-22-23508800; E-mail: nklimingchun@yahoo.com.cn

国家自然科学基金 (No. 30771355)，国家高技术研究发展计划 (863计划) (No. 2007AA10Z189)，教育部博士点基金新教师项目 (No. 20070055061)资助。