不同pH调节剂对产琥珀酸放线杆菌NJ113发酵产丁二酸的影响

杨卓娜，姜岷，李建，方晓江，叶贵子，白雪飞，郑晓宇，韦萍

南京工业大学生物与制药工程学院 材料化学工程国家重点实验室，南京 210009

工业生物技术

不同pH调节剂对产琥珀酸放线杆菌NJ113发酵产丁二酸的影响

杨卓娜，姜岷，李建，方晓江，叶贵子，白雪飞，郑晓宇，韦萍

南京工业大学生物与制药工程学院 材料化学工程国家重点实验室，南京 210009

在 3 L发酵罐中分别采用不同的碱性物质作为 pH调节剂，考察其对产琥珀酸放线杆菌Actinobacillus succinogenesNJ113厌氧发酵制备丁二酸的影响。结果表明：Ca2+、NH4+调节剂对菌体生长代谢有较大阻碍作用，丁二酸产量较低；采用含 Na+调节剂，在发酵中后期菌体出现絮凝现象严重，且产丁二酸能力骤降；采用含 Mg2+调节剂，整个发酵过程菌体代谢旺盛，发酵效果较佳。根据各碱性物质的调节能力以及对菌体生长代谢的影响，选择 NaOH、Mg(OH)2和Na2CO3、Mg(OH)2分别作为混合碱组分调节pH，并对两组混合碱中各物质的质量比例进行优化。结果表明，以NaOH、Mg(OH)2混合，两者质量比为1∶1时，发酵效果最好，丁二酸质量浓度高达到69.8 g/L，质量收率74.5%。该种混合碱配比可有效替代碱式MgCO3调节pH，既达到高产丁二酸的目的，又可降低生物制备丁二酸的成本。

pH调控，产琥珀酸放线杆菌NJ113，丁二酸，发酵，混合碱

Abstract:Different neutralizing agents were used as pH controller to investigate their effects on the growth and succinic acid production ofActinobacillus succinogenesNJ113. The fermentation results showed that Ca(OH)2, CaCO3and NH4OH were not suitable for succinic acid production byA. succinogenesNJ113 because of their negative effects on cell growth. When Na-base was used, cells would flocculate and lump, and due to the sodium ion concentration reaching to a high level,OD660dropped sharply after 12 h of fermentation. Mg-base was better because there was no significant inhibition by magnesium ion. Two combined neutralizing agents were used to maintain pH level, one with NaOH and Mg(OH)2while the other with Na2CO3and Mg(OH)2. The optimum ratios of the combined neutralizing agents were both 1:1(g:g) when using 100 g/L glucose. When NaOH and Mg(OH)2were chosen with the ratio of 1:1(g:g), 69.8 g/L of the succinic acid and 74.5% of the yield was obtained.

Keywords: pH control,Actinobacillus succinogenesNJ113, succinic acid, fermentation, mixed neutralizing agents

丁二酸，又名琥珀酸，是一种二元羧酸，作为重要的C4平台化合物，广泛应用于食品、医药、香料、洗涤剂、精细化工产品、表面活性剂生物可降解材料等方面。丁二酸的传统生产方法是以石油为原料用化学法进行炼制合成。而随着石油资源日益枯竭，微生物发酵法生产丁二酸以其环境友好性、可利用废弃的生物质资源、能够固定温室气体 CO2等优点，成为研究的热门课题，为已存在的丁二酸化学制品市场提供一种新型的环保产品来源[1]。

以生物法制备丁二酸，CO2、pH是影响菌体生长和丁二酸产量的关键因素[2-3]。CO2在菌体的生长代谢过程中作为碳源被菌体利用，合成目的产物丁二酸。环境pH的改变不仅会引起菌体内外部化学环境和酶活力的变化，对细胞代谢产生影响，而且还可以影响CO2的溶解水平，以及HCO3−、CO32−的解离平衡，进而影响丁二酸的合成。所以在发酵过程中维持pH在适宜水平，对提高菌体的代谢活性和产酸能力具有重要作用。

产琥珀酸放线杆菌发酵最佳pH为7.0[4]。在发酵过程中，有机酸的积累会导致pH下降，需要添加pH调节剂来维持环境的中性水平。MgCO3是较好的中和剂[3]，具有较好的调节能力。在发酵培养基中添加MgCO3固体，能够将pH维持在适宜的水平，菌体在发酵过程中表现出较高的代谢活性。但是MgCO3成本较高，消耗量较大，且增加了下游产品分离提取的难度，不利于生物法制备丁二酸的工业化。因此，需要选择合适的pH调节剂并制定合理的调节策略来优化生产工艺，降低生物制备丁二酸的生产成本。

初糖浓度对菌体发酵产酸有重要影响。较高的初糖浓度会延长菌体的延滞期，降低最大菌体量，但是能够提高丁二酸的绝对产量[2]。本文采用Ca(OH)2、CaCO3、NaOH、Na2CO3、NaHCO3、Mg(OH)2、碱式 MgCO3作为 pH调节剂，考察不同pH调节方式对A. succinogenesNJ113厌氧发酵产丁二酸的影响。根据以上各碱性物质的调节能力和特性制定了采用混合碱调控pH的策略，并确定混合成分及其最佳配比，为优化丁二酸发酵工艺提供有价值的技术参数。

1 材料与方法

1.1 菌种

产琥珀酸放线杆菌Actinobacillus succinogenesNJ113，保存号CGMCC 1716，本实验室筛选并保存。

1.2 培养基

种子培养基 (g/L)：葡萄糖10 (分消)，酵母膏5，NaHCO310，NaH2PO4·2H2O 9.6，K2HPO4·3H2O 15.5；pH 6.8，121℃灭菌15 min。

发酵培养基 (g/L)：葡萄糖80～100，酵母膏10，KH2PO43，MgCl2·6H2O 0.3，CaCl20.3，NaCl 1，Na2HPO40.31，NaH2PO41.6，121℃灭菌 15 min。葡萄糖 121℃分消 15 min 后单独加入。固体CaCO3、碱式MgCO3在灭菌前加入发酵培养基中，其他碱液以流加形式加入，控制pH在7.0。实验数据均重复3次，取平均值。

1.3 培养方法

1.3.1种子培养

冻存于−70℃冰箱的菌种，接到种子培养基中，120 r/min，37℃活化10 h后作为种子液。

1.3.2分批发酵培养

在3 L发酵罐 (BioFlo 110 fermenter；NBS) 进行分批发酵培养，装液量为1.5 L，接种量5%。搅拌转速 200 r/min，温度37℃，CO2通气量0.25 L/min。

1.4 分析方法

1.4.1葡萄糖含量的测定

生物传感分析仪 (SBA240C，山东省科学院生物研究所)。

1.4.2有机酸含量测定

采用高效液相方法 (HPLC) 测得有机酸[5](戴安 Ultimate3000系列)。色谱柱：Alltech Prevail Organic Acid (250 mm×φ4.6 mm，5 μm)，流动相：25 mmol/L KH2PO4；pH 2.5；流动相流速：1 mL/min；紫外检测波长：215 nm；进样量20 μL；柱温为室温。采用Ca2+调节时，用HCl调节离心后沉淀的pH至2.5，使少量沉淀丁二酸钙溶解，经离心后采用高效液相方法测得上清液中丁二酸含量。

1.4.3菌体浓度的测定

取1 mL菌液，稀释若干倍，用紫外可见分光光度计 (Spectrumlab 752S) 于660 nm (OD660) 处测定吸光值。若发酵液中含有Mg(OH)2或MgCO3，稀释前在待测样中加入适量2 mol/L HCl，再进行吸光值测定。

1.4.4菌体干重的测定

将干燥10 mL离心管称重 (G1)，取5 mL发酵液于离心管中，10 000 r/min离心10 min，倒出上清液，5 mL 0.9%的生理盐水洗涤2次，将沉淀物连同离心管置于60℃烘箱中烘干至恒重，取出称重 (G2)：

细胞干重W (g/mL) = (G2−G1)/5。

2 结果

2.1 不同 pH 调节剂对菌体生长和丁二酸产量的影响

2.1.1Ca2+调节剂 (Ca(OH)2、CaCO3)

在3 L发酵罐中分别采用Ca(OH)2、CaCO3调节pH进行发酵，初始葡萄糖80 g/L，结果见图1。采用 Ca(OH)2调节，菌体几乎不生长，丁二酸质量浓度小于5 g/L (图1A)。采用事先添加CaCO3调节pH发酵，菌体生长比 Ca(OH)2调节发酵时稍好，但仍受到明显抑制。CaCO3的溶解能力差，不能将pH维持在适合菌体生长的水平，发酵过程中 pH不断降低，至发酵结束，pH降至5.6 (图1B)，丁二酸产量仅为17.5 g/L。

图1 采用2.5 mol/L Ca(OH)2(A) 和40 g/L CaCO3(B) 调节pH的发酵过程图Fig.1 Time courses of the succinic acid fermentation using 2.5 mol/L Ca(OH)2(A) and 40 g/L CaCO3(B) to buffer pH.

已有研究表明，Ca2+对丁二酸生产菌Mannheimia succiniciproducens具有毒害作用[6]。Ca2+可以改变细胞膜正常的流动性和通透性[7]，致使菌体不能进行正常的胞内外物质能量传递，从而无法生长代谢。

2.1.2Na+调节剂 (NaOH、Na2CO3、NaHCO3)

在 3 L发酵罐中分别采用 NaOH、Na2CO3、NaHCO3调节 pH，发酵过程见图 2。发酵前期，菌体生长旺盛，大量合成产物丁二酸，至中后期菌体OD660均呈明显下降趋势，菌体絮凝现象严重，丁二酸的生产能力也逐渐下降。对比发酵结果 (表1) 可知，采用NaOH调节，丁二酸产量最高，为41.94 g/L，但是糖利用率较仅有66.67%，有较多葡萄糖残留，发酵液中积累的 Na+达到 2.1 mol/L。Na2CO3、NaHCO3能够提供额外的 CO32−、HCO3−，有利于菌体合成丁二酸，但是两者溶解性和碱性均较低，流加过程对发酵液的稀释作用显著，以 NaHCO3尤为严重，虽然糖利用率较高 (98.7%)，但是丁二酸质量浓度仅为37.77 g/L。

表1 采用不同含Na+调节剂发酵结果的对比aTable 1 Results of succinic acid production using different Na-base for pH control

图2 采用 10 mol/L NaOH (A)、2.5 mol/L Na2CO3(B)和2.4 mol/L NaHCO3(C) 调节pH的发酵过程图Fig.2 Time courses of the succinic acid fermentation using 10 mol/L NaOH (A), 2.5 mol/L Na2CO3(B) and 2.4 mol/L NaHCO3(C) to buffer pH at 7.0.

在细胞的代谢过程中，Na+有十分重要的作用，它能够影响跨膜pH梯度、细胞渗透压以及胞内pH调控水平[8]。Pyung等报道，当培养基中NaCl质量浓度高于4 g/L时，Anaerobiospirillum succinicproducens最高OD660值呈现下降趋势，丁二酸的产量也随之下降[9]。在发酵过程中采用含Na+调节剂，则Na+不断积累。至发酵中后期，发酵液中 Na+浓度均处于较高水平，造成高渗环境。这对菌体有较大的负面作用，使细胞不能正常代谢，最终导致衰亡。

2.1.3Mg2+调节剂 (Mg(OH)2、碱式MgCO3)

Mg2+是许多酶的激活剂，在丁二酸合成途径中的关键酶——磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶需要Mg2+作为辅助因子[10]。图3是分别采用Mg(OH)2、MgCO3调节pH的发酵过程，初始葡萄糖浓度80 g/L。Mg2+在发酵液中的积累对菌体生长没有明显的抑制作用，发酵中后期，OD660缓慢下降，菌体仍有较高的代谢活性。采用Mg(OH)2调节，由于碱液流加的稀释作用，丁二酸质量浓度仅为42.92 g/L (图3A)。以碱式MgCO3调节pH，发酵效果最佳，至发酵结束，丁二酸质量浓度达 57.36 g/L (图 3B)，质量收率为71.86%。

图3 采用 (A) 15% Mg(OH)2和 (B) 70 g/L碱式MgCO3调节pH的发酵过程图Fig.3 Time courses of the succinic acid fermentation using 2.6 mol/L Mg(OH)2(A) and 70 g/L MgCO3(B) to buffer pH at 7.0.

2.1.4NH4+调节剂 (氨水)

氨水调节pH的发酵过程如图4所示。发酵液中NH4+对细胞生长的抑制作用较为强烈，菌体对糖的利用能力较低，导致大量的葡萄糖残留。至发酵结束，丁二酸质量浓度仅为23.5 g/L。

细胞膜对NH4+有较高的通透性[11]，NH4+的渗入会造成胞内pH水平发生变化，细胞需要更多的能量将 NH4+泵出，可见，环境中较高 NH4+浓度会降低细胞对能量的利用效率。当能量供给不足时，受胞内NH4+的影响，胞内的pH发生变化，影响细胞无法正常的生长代谢，最终导致死亡[11-13]。

图4 采用14 mol/L氨水调节pH的发酵过程图Fig.4 Time course of the succinic acid fermentation using 14 mol/L NH4OH to buffer pH at 7.0.

通过上述实验结果可得，采用含Ca2+、NH4+调节剂，菌体生长受到较强的抑制作用，产酸能力较低，所以这两类调节剂不适用于A. succinogenesNJ113产丁二酸的pH控制；采用含Na+调节剂，在发酵中后期菌体絮凝现象严重，耗糖速率、产丁二酸酸能力迅速下降；Mg2+调节剂对菌体的生长和代谢没有明显的抑制作用，菌体在发酵过程中保持较高的活力。综合各类调节剂对发酵过程的影响，后续实验采用 NaOH、Mg(OH)2和 Na2CO3、Mg(OH)2两种混合碱分别调节pH，以弥补单碱调节的不足。

2.2 混合碱调节 pH 对菌体生长以及丁二酸产量的影响

2.2.1NaOH和Mg(OH)2不同的混合比例调节pH对发酵结果的影响

用NaOH和Mg(OH)2混合溶液作为pH调节剂，初始葡萄糖100 g/L，在3 L发酵罐中考察调控效果。控制混合碱中OH−浓度为6 mol/L (按1 mol Mg(OH)2提供 2 mol OH−计)，NaOH 和 Mg(OH)2质量比为3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3，结果见图 5。

从图5中可看出，随着混合碱液中NaOH添加比例降低，葡萄糖的残留量逐渐减少。当NaOH和Mg(OH)2的质量比为1∶1时，无葡萄糖剩余，丁二酸的质量浓度最高可达69.8 g/L，发酵液中Na+浓度为0.86 mol/L，与采用NaHCO3调节的Na+浓度相比，降低了42.6%。继续减少混合碱中NaOH的添加比例，菌体仍然能够将葡萄糖全部耗完，但是混合碱的稀释作用逐渐显著，丁二酸质量浓度呈现下降趋势。

图5 不同比例的NaOH和Mg(OH)2混合调节pH对发酵结果的影响Fig.5 Comparison of different ratio of NaOH and Mg(OH)2on production of succinic acid in batch fermentation.

2.2.2Na2CO3和Mg(OH)2不同的混合比例调节pH对发酵结果的影响

采用 Na2CO3和 Mg(OH)2以不同比例混合(3∶1、2∶1、1∶1∶2、1∶3) 调节 pH，控制混合碱中 OH−浓度为 6 mol/L (按 1 mol Na2CO3提供2 mol OH−计)，初始葡萄糖100 g/L。发酵结果见图6。随着Mg(OH)2添加量的不断增加，葡萄糖剩余量逐渐减少，丁二酸质量浓度逐渐增大。当 Na2CO3和Mg(OH)2质量比达到1∶1时，葡萄糖无剩余，丁二酸质量浓度最高，为55.4 g/L，发酵液中Na+浓度0.95 mol/L，比采用NaHCO3调节的Na+浓度降低了36.7%。继续增加混合碱中 Mg(OH)2添加量，葡萄糖仍然能够消耗完全，但是丁二酸的浓度有所下降。

图6 不同比例的Na2CO3和Mg(OH)2混合调节pH对发酵结果的影响Fig.6 Comparison of different ratio of Na2CO3and Mg(OH)2on production of succinic acid in batch fermentation.

含 Na+调节剂与含 Mg2+调节剂混合至适当比例，既缓解了 Na+的过量积累，提高菌体对糖的利用率，又降低了Mg(OH)2对发酵液的稀释程度。与Na2CO3和Mg(OH)2混合调节pH发酵的最佳结果相比，采用NaOH和Mg(OH)2以1∶1混合调节pH发酵的效果更好。

表 2的对比结果可知，以 NaOH和 Mg(OH)21∶1混合调节pH，在高糖浓度下进行丁二酸发酵，菌体能够有效利用碳源进行产物合成，丁二酸的产量以及收率与碱式MgCO3发酵结果相近。同时，采用混合碱发酵，能够有效降低丁二酸的生产成本，具有工业应用的潜质。

表2 混合碱与碱式MgCO3调节pH发酵结果对比Table 2 Results of succinic acid production using mixed neutralizing agents and MgCO3for pH control respectively

3 讨论

不同的碱性物质对A. succinogenesNJ113厌氧发酵产丁二酸表现出不同的调节能力。采用含Ca2+、NH4+调节剂进行发酵时，菌体生长受阻，对糖的利用能力较低，产物丁二酸的合成量较少。采用含Na+调节剂，发酵中后期 Na+造成的高渗环境对菌体有毒害作用，菌体代谢能力骤降，糖利用率较低。而含Mg2+调节剂对菌体的生长与代谢没有明显的阻碍作用，细胞能够保持较高的代谢活性。

根据上述结果，本实验采用混合碱调节策略，即以 NaOH、Mg(OH)2和 Na2CO3、Mg(OH)2混合分别控制 pH，以改善在高糖浓度下菌体对糖利用率低、丁二酸合成量少等问题。采用NaOH、Mg(OH)2质量比 1∶1混合调节 pH，发酵效果最佳，丁二酸质量浓度最高，可达69.8 g/L，质量收率达到74.5%。以该种混合碱配比调节pH发酵效果较好，可能是由于在该种混合配比下，Mg2+能够及时有效地与丁二酸根形成络合结构[14]，且Mg2+的供给速率与丁二酸的生产速率达到一定的平衡，在保证pH维持在适宜水平的前提下，降低产物对菌体活性的抑制作用。Sergio等报道在添加Mg2+能够提高PEP羧化激酶的活性[15]。PEP羧化激酶是合成产物丁二酸的关键酶，PEP羧化激酶活力的提高，能够促进 PEP转化为OAA，进一步合成目标产物丁二酸。同时，Mg2+也能够提高胞内高能化合物的储备，为胞内代谢以及胞内外的物质运输提供更多能量支持[16]。在混合碱中，Na+浓度得到有效控制，削弱了Na+对环境的高渗作用，有利于菌体的正常代谢。因此，采用混合碱的pH调节策略，能够充分弥补单碱调节的不足，改善在高糖浓度下菌体对糖利用率低、丁二酸合成量少等问题，达到高产丁二酸的目的；同时，与碱式碳酸镁的发酵效果相近，可有效降低生物制备丁二酸的成本，为优化生物制备丁二酸的生产工艺奠定良好的基础。

REFERENCES

[1] Zeikus JG, Jain MK, Elankovan P. Biotechnology of succinic acid production and markets for derived industrial products.Appl Microbiol Biotechnol, 1999,51(5): 545−552.

[2] Pyung CL, Woo GL, Sunhoon K,et al. Succinic acid production byAnaerobiospirillum succiniciproducens:effects of the H2/CO2supply and glucose concentration.Enzyme Microbial Technol, 1999, 24(8): 549−554.

[3] Guettler MV, Jain MK, Rumler D. Method for makingsuccinic acid, bacterial variants for use in the process, and methods for obtaining variants: US, 5573931. 1996-11-12.

[4] Su L, Chen KQ, Cai T,et al. Research on anarobic cultural condition of succinic acid producing strainActinobacillus succinogenes130Z.Chin J Bioproc Eng, 2007, 5(2): 67−72.

苏溧, 陈可泉, 蔡婷, 等.Actinobacillus succinogenes130Z厌氧发酵产丁二酸条件初步研究. 生物加工过程,2007, 5(2): 67−72.

[5] Cai T, Su L, Chen KQ,et al. Application of HPLC in determination of organic acids in succinic acid anaerobic fermentation broth.Chin J Bioproc Eng, 2007, 5(1):66−69.

蔡婷, 苏溧, 陈可泉, 等. 高效液相色谱法在测定丁二酸厌氧发酵体系中有机酸的应用. 生物加工过程, 2007,5(1): 66−69.

[6] Hyohak S, Jeong WL, Sol C,et al. Effects of dissolved CO2levels on the growth ofMannheimia succiniciproducensand succinic acid production.Biotechnol Bioeng, 2007,98(6): 1296−1304.

[7] Wang JY, Zhu SG, Xu CF. Biochemistry. Beijing: Higher Education Press, 2002: 598−599.

王镜岩, 朱圣庚, 徐长法. 生物化学. 北京: 高等教育出版社, 2002: 598−599.

[8] Liu YP, Zheng P, Sun ZH,et al. Strategies of pH control and glucose-fed batch fermentation for production of succinic acid byActinobacillussuccinogenesCGMCC1593.J Chem Technol Biotechnol, 2008, 83(5): 722−729.

[9] Pyung CL, Woo GL, Sang YL,et al. Effects of medium components on the growth ofAnaerobiospirillum succiniciproducensand succinic acid production.Process Biochem, 1999, 35: 49−55.

[10] Podkovyrov SM, Zeikus JG. Purification and characterization of phosphoenolpyruvate carboxykinase, a catabolic CO2-fixing enzyme, fromAnaerobiospirillum succiniciproducens.J Gen Microbiol, 1993, 139: 223−228.

[11] Kleiner D. Energy expenditure for cyclic retention of NH3NH4+during N2fixation byKlebsiella pneumoniae.FEBS Lett, 1985, 187(2): 237−239.

[12] Buurman ET, Teixeira de Mattos MJ, Neijssel OM.Nitrogen-limited behaviour of micro-organisms growing in the presence of large concentrations of ammonium ions.FEMS MicrobioI Lett, 1989, 49(2): 229−232.

[13] Buurman ET, Teixeira de Mattos MJ, Neijssel OM. Futile cycling of ammonium ions via the high affinity potassium uptake system (Kdp) ofEscherichia coli.Arch Microbiol,1991, 155(4): 391−395.

[14] Li XJ, Hu KL, Huang YL. IR Spectra of dicarboxulate of Alkali-eaeth metal.Spectroscopy Spectral Anal, 2002,22(3): 392−395.

李小俊, 胡克良, 黄允兰. 红外光谱对碱土金属二元羧酸盐结构的研究. 光谱学与光谱分析, 2002, 22(3):392−395.

[15] Sergio B, Mauricio T, Maris L,et al. Comparative kinetic effects of Mn (II), Mg (II) and the ATP/ADP ratio on phosphoenolpyruvate carboxykinases fromAnaerobiospirillum succiniciproducensandSaccharomycescerevisiae.Protein J, 2007, 26(4): 265−269.

[16] Wang F, Du GC, Gu ZB. The promoting effects of magnesium, manganese and zinc ions on theγ-CGTase production and the energy metabol ism byBacillus macorous.Chem Bioeng, 2008, 25(7): 33−37.

王峰, 堵国成, 顾正彪. 镁锰锌金属离子对γ-CGT酶生产和能量代谢的促进影响. 化学与生物工程, 2008,25(7): 33−37.

Effects of different neutralizing agents on succinate production byActinobacillus succinogenesNJ113

Zhuona Yang, Min Jiang, Jian Li, Xiaojiang Fang, Guizi Ye, Xuefei Bai, Xiaoyu Zheng,and Ping Wei

State Key Laboratory of Materials-Oriented Chemical Engineering,College of Biotechnology and Pharmaceutical Engineering,Nanjing University of Technology,Nanjing210009,China

Received:January 29, 2010;Accepted:May 14, 2010

Supported by:National Basic Research Program of China (973 Program) (No. 2009CB724701), National Natural Science Foundation of China (No.20606017), State Key Laboratory of Materials-Oriented Chemical Engineering, “Qinglan Project” of Jiangsu Province, “The Six Talent Summit” of Jiangsu Province (No. 06-A-047).

Corresponding author:Min Jiang. Tel: +86-25-83172078; Fax: +86-25-83172075; E-mail: jiangmin@njut.edu.cn

国家重点基础研究发展计划 (973计划) (No. 2009CB724701)，国家自然科学基金 (No. 20606017)，材料化学工程国家重点实验室基金，江苏省“青蓝工程”，江苏省“六大人才高峰”(No. 06-A-047) 资助。