灵芝免疫调节蛋白LZ-8的制备和晶体分析

安敏，高福，齐建勋，李锋，刘杏忠

中国科学院微生物研究所 真菌地衣系统学重点实验室，北京 100101

医学与免疫生物技术

灵芝免疫调节蛋白LZ-8的制备和晶体分析

安敏，高福，齐建勋，李锋，刘杏忠

中国科学院微生物研究所 真菌地衣系统学重点实验室，北京 100101

LZ-8蛋白是从灵芝菌丝中分离到的真菌免疫调节蛋白，具有多种免疫调节功能，然而这一蛋白的作用机制尚不清楚。通过蛋白质晶体结构的解析，能够得到蛋白质空间结构特点，从而阐述蛋白质功能的机制。旨在得到LZ-8蛋白的晶体，并获得空间结构数据。以pET21a为表达载体，获得诱导表达的rLZ-8，通过亲和层析、分子筛凝胶层析和阴离子交换层析纯化，蛋白纯度在98%以上，采用悬滴气相扩散法得到蛋白晶体，并获得3.2Å数据，为进一步对真菌免疫调节蛋白功能和结构的研究奠定了基础。

LZ-8，真菌免疫调节蛋白，晶体衍射

Abstract:LZ-8 protein, isolated from a well known Chinese traditional medicinal fungusGanoderma lucidum, is the first member of fungal immunomodulatory protein, members of which have been isolated from a variety of medicinal and edible mushrooms in the last two decades. The protein plays a multifunctional and important role in modulating immune system. In this report, in order to get LZ-8 protein crystals, the LZ-8 gene was expressed and purified by affinity chromatography, gel filtration chromatography and anion exchange chromatography subsequently. The protein was then crystallized using the hanging-drop vapour-diffusion method. The LZ-8 crystals were obtained and the phase information was calculated by X-ray diffraction. The resolution of LZ-8 crystals is 3.2Å. This study will provide an insight into the structure of fungal immunomodulatory proteins.

Keywords:LZ-8, fungal immunomodulatory protein, crystal diffraction

担子菌纲多孔菌目灵芝属的灵芝Ganoderma lucidum是传统中医学中被广泛应用的一种中药材，在我国的众多古典医学资料中都对它有详尽的描述。作为一种重要的中药材，灵芝在抗肿瘤、保肝解毒、治疗心血管系统疾病、抗神经衰弱作用、抗菌消毒以及抗衰老等多种临床应用方面具有良好的效果[1]。经过研究分析，灵芝中的主要有效化学成分包括多糖类化合物、甾、萜类化合物、生物碱、氨基酸和蛋白质等多种物质[1]。其中在灵芝中发现的真菌免疫调节蛋白LZ-8 (LingZhi-8)[2]成为了近几年来研究的热点。

1989年日本科学家 Kino首次从灵芝菌丝体中提取到了一个由111个氨基酸构成的12 kDa大小的小分子蛋白——LZ-8蛋白。之后，科学家又从药、食用真菌松杉灵芝G. tsugae[3]、金针菇Flammulina velutipers[4]、草菇Volvariella volvacea[5]、牛樟芝Antrodia camphorata[6]、紫芝G. sinensis[7]等真菌菌丝或子实体中提取到了性质、功能与LZ-8非常相似的蛋白，科学家将这一类蛋白归为同一个蛋白家族，命名为真菌免疫调节蛋白 (Fungal immunomodulatory protein，FIP) 家族。以LZ-8为代表的这一蛋白家族具有很多类似的免疫调节功能。在体外，LZ-8可以刺激DBA/2小鼠[8]、非肥胖性I型糖尿病小鼠脾淋巴细胞[9]增殖，促进单核细胞起源的树突状细胞(DC) 的活化和成熟[10]，而且用酵母异源表达的LZ-8蛋白可以促进巨噬细胞的吞噬作用[11]。这种增殖功能也有类似于凝集素的剂量依赖特点，但不会因为多糖或者单糖的加入而受到抑制[2]。在体内，LZ-8蛋白可以防止非肥胖性I型糖尿病小鼠由自身免疫系统缺陷造成的胰腺炎的发生[9]，同时也能够抑制阿尔图斯 (Arthus) 过敏反应[2]，可能原因是LZ-8蛋白能够抑制由特殊抗原引起的抗体产生[12]，因此在移植外源胰脏的小鼠体内腹腔注射 LZ-8蛋白可以抑制胰脏的排异反应，延长小鼠寿命[13]。此外，LZ-8蛋白可以促进黏附分子ICAM-1的表达[14]，从而促进了免疫分子与其他细胞分子间的相互黏合，以达到发挥免疫调节的功能。同时，与LZ-8蛋白氨基酸序列完全相同的松杉灵芝免疫调节蛋白(FIP-gts) 可以促进人类外周血淋巴细胞分泌白介素2 (IL-2)、白介素 4 (IL-4)、肿瘤坏死因子 α (TNF-α) 和干扰素γ (INF-γ) 等细胞因子[3]，调节人类体液免疫。

虽然以 LZ-8蛋白为代表的真菌免疫调节蛋白家族的功能已经得到了多方面的研究，然而这类蛋白的作用机制仍没有得到很好的阐述。由于蛋白质的高级结构决定了蛋白质所具有的功能，因此对蛋白质三维结构的研究能够从本质上揭示蛋白的作用机制。2003年，该家族的第一个晶体结构——金针菇免疫调节蛋白 (FIP-fve) 的晶体结构被解析，对这个家族蛋白的结构特点有了初步了解，然而并不能完全解释该蛋白家族功能机制[15-17]。本研究通过原核系统大量表达重组LZ-8蛋白，采用悬滴气相扩散法得到蛋白结晶，利用 X-光晶体衍射技术获得LZ-8蛋白在分辨率为3.2 Å空间结构的信息。

1 材料与方法

1.1 菌种与质粒

灵芝G. lucidum菌种444为中国科学院微生物研究所文华安教授提供；克隆宿主菌E. coliDH5α，表达宿主菌E. coliBL21(DE3)，表达质粒 pET21a均由本实验室保存。

1.2 化学试剂和材料

蛋白胨、酵母抽提物购自Oxoid公司。各种工具酶、混合dNTPs、DNA电泳分子量标准、pMD18-T simple载体购自大连TaKaRa公司。质粒提取试剂盒购自北京博大泰克生物技术公司。DNA凝胶回收试剂盒购自Promega公司。Ni-NTA Agarose购自GE公司。BCA蛋白浓度测定试剂盒购自Thermo Fisher公司。分子筛柱Superdex 75 10/300 GL和阴离子交换柱Resource Q均为Amersham Bioscience公司生产。晶体初筛试剂盒购自Hampton Research公司。引物合成和测序反应由上海英骏生物技术有限公司完成。其他各种化学试剂为进口或国产分析纯试剂。

1.3 培养基

LB培养基：NaCl 10 g/L，蛋白胨10 g/L，酵母抽提物5 g/L，Amp终浓度100 μg/mL。PDA综合培养基：葡萄糖20 g/L；蛋白胨3.0 g/L；KH2PO43.0 g/L；MgSO4·7H2O 1.5 g/L；维生素 B120 mg/L；马铃薯浸取液 (去皮马铃薯200 g，切成小块，加水1.0 L煮沸30 min，滤去马铃薯块，将滤液补足至1.0 L)；pH 6.0。

1.4 重组质粒pET21a-LZ-8的构建

将菌种444在PDA综合培养基培养2周后，收集菌丝球。由于LZ-8基因中不含内含子[2]，因此利用酚-氯仿法提取菌种的基因组DNA作为PCR反应的模板。PCR反应条件如下：95 ℃ 3 min ；95℃30s，55℃30s，72℃45 s，循环 30次；72 ℃ 10 min 。PCR 引物如下：F：5′-GGAATTCCATATGATGTCCG ACACTGCCTTGAT-3′，R：5′-GGAATTCTTAATGAT GATGATGATGATGAGTTCCACTGGGCG-3′。引物R含有表达6个His的序列，F和R分别含有NdeI和EcoRI的限制性酶切位点 (下划线部分为酶切位点)，将扩增后的目的片段经过酶切、纯化连接到表达载体 pET21a上，构建重组质粒 pET21a-LZ-8。重组质粒通过酶切鉴定和 DNA测序来确保其准确性。

1.5 rLZ-8蛋白的表达纯化

将重组质粒转化入BL21(DE3) 感受态细胞中，在37℃条件下用1 mmol/L IPTG诱导4 h，得到可溶性表达的目的蛋白。大量摇菌、超声破碎后，将离心得到的上清与Ni-NTA Agarose结合2 h。之后用200 mmol/L的咪唑溶液洗脱目的蛋白。浓缩后进一步通过凝胶层析法和阴离子交换层析得到纯化的带有His-tag的rLZ-8蛋白。

1.6 rLZ-8蛋白的晶体生长

利用结晶试剂盒，采用悬滴法筛选 rLZ-8蛋白晶体培养条件。通过初筛条件，改变沉淀剂浓度、盐浓度、pH值以及蛋白浓度进行优化。最终在沉淀剂为 0.6 mol/L酒石酸钾钠 (Potassium sodium tartrate)，缓冲液0.1 mol/L 1,3-二［三 (羟甲基) 甲氨基］丙烷 (Bis-tris propane)，pH 7.5的条件下获得可供衍射的晶体，此时蛋白浓度为5 mg/mL。

1.7 解析结构方法

利用分子置换法解析结构。

2 结果

2.1 重组质粒pET21a-LZ-8的构建和表达

利用灵芝的基因组 DNA为模板，PCR扩增得到LZ-8基因片段，纯化回收后将其连接在pMD18-T simple载体上，经菌落PCR和双酶切鉴定后，挑取阳性克隆，提取质粒，并利用NdeI和EcoRI进行双酶切。回收纯化双酶切后获得的片段，连接到pET21a载体中。将连接产物转化入大肠杆菌DH5α，挑取阳性克隆，提质粒进行双酶切鉴定，最后进行测序验证，最终获得重组质粒命名为 pET21a-LZ-8(图 1)。

图1 LZ-8基因PCR扩增及重组质粒双酶切鉴定Fig.1 PCR amplification of LZ-8 gene and double enzyme digestion of the recombinant plasmid. (A) PCR amplification of LZ-8 gene. M: DNA marker; 1: PCR product of LZ-8. (B)Double enzyme digestion of the recombinant plasmid. M: DNA marker; 2: double enzyme digestion of pET21a-LZ-8 byNdeI andEcoR I.

2.2 rLZ-8蛋白的表达纯化

将测序鉴定正确的重组质粒转入表达宿主菌BL21(DE3) 中，挑取单克隆后液体培养，在OD500达到0.4～0.6之间时加入1 mmol/L IPTG进行诱导表达。SDS-PAGE分析表明，在接近14 kDa处有一条明显的目的蛋白带。超声裂解细菌后离心，目的蛋白以可溶性蛋白形式存在，表达量很高 (图2)。

图2 SDS-PAGE分析rLZ-8表达产物Fig.2 SDS-PAGE analysis of the expression of rLZ-8. M:protein marker; 1−3: rLZ-8 expression after induced by IPTG;4: negative control; 5: the supernatant after sonicating the cells expressing rLZ-8.

将超声裂解细菌的产物在4℃下16 000 r/min高速离心10 min，取上清与Ni-NTA Agarose结合4 h，用50 mmol/L咪唑溶液清洗结合到层析柱上的杂蛋白直到蛋白检测液不再变蓝，之后用200 mmol/L的咪唑溶液将目的蛋白洗脱。浓缩洗脱下来的目的蛋白至体积约为5 mL，加样至Superdex 75 10/300 GL进行凝胶层析。主峰中的样品经SDS-PAGE验证是LZ-8重组蛋白。蛋白出峰位置的分子量约为28 kDa，是蛋白形成二聚体后的分子量大小，即带有His-tag的rLZ-8蛋白与天然状态的 LZ-8蛋白一样是以二聚体形式存在 (图3)。将主峰中的蛋白收集，浓缩到5 mL左右，再通过阴离子交换层析进一步纯化。通过SDS-PAGE的验证，阴离子交换层析主峰中的蛋白为目的蛋白 (图4)。

图3 rLZ-8蛋白分子筛层析图Fig.3 Superdex 75 gel filtration profile of the rLZ-8 protein.The main peak is rLZ-8 protein.

图4 rLZ-8蛋白阴离子交换层析图Fig.4 Further purification of the rLZ-8 protein by anion exchange. M: protein marker. The main peak is rLZ-8 protein.

2.3 rLZ-8蛋白晶体的生长

将阴离子交换层析纯化后主峰中的蛋白浓缩至 5 mg/mL的浓度，利用悬滴法以及晶体试剂盒对蛋白进行晶体形成条件初筛。在初筛约24 h后，观察发现在Salt以及Crystal试剂盒的22个条件有晶体长出，利用 X-ray衍射鉴定是蛋白质晶体。初筛时的蛋白晶体个体较小，形状不规则，很多小晶体混杂生长在一起，衍射率较低 (图5A)。之后，对初筛时晶体生长较大、较结实的条件进行盐离子浓度和pH值的梯度优化，在0.6 mol/L酒石酸钾钠沉淀剂、0.1 mol/L Bis-tris propane缓冲液 (pH 7.5)的条件下得到了分辨率为3.2 Å的晶体。经过优化的晶体个体较大，形状为较规则的六边形，晶体为单个晶体，而且比较厚实，分辨率较高 (图5B)。

图5 初筛 (A) 及优化 (B) 条件的rLZ-8晶体形态Fig.5 Initial (A) and optimized (B) crystals of the rLZ-8 protein.

2.4 rLZ-8晶体衍射数据的收集

利用 X-ray衍射设备收集优化后的蛋白质晶体中各原子的衍射数据 (图6)。优化数据至3.2 Å。晶体属于P6422空间群，晶胞参数分别为：a=b=76.473 Å，c=177.476 Å，α=β=90°，γ=120°。通过进一步的晶体优化可以解析蛋白结构 (表 1)。目前正在应用分子置换的方法进行结构解析。

表1 rLZ-8蛋白晶体的衍射数据Table 1 X-ray diffraction data of the rLZ-8 protein

图6 rLZ-8蛋白晶体X射线衍射图Fig.6 Typical diffraction pattern of the rLZ-8 protein.

3 讨论

本文通过原核表达，获得带有His-tag的灵芝免疫调节蛋白LZ-8，通过分子筛层析显示为二聚体蛋白，与天然LZ-8蛋白相同，均为二聚体蛋白。天然的 LZ-8蛋白不含有 Met、Cys、His[2,17]，所以它们是由非共价键作用形成二聚体的。由于重组表达的LZ-8蛋白中也不含Cys、Met，因此重组蛋白也是由非共价键作用而生成的二聚体蛋白。这一结构与已经解析结构的FIP-fve一致。LZ-8与FIP-fve在氨基酸序列上相似性很高，推测LZ-8与FIP-fve应该有很相似的晶体结构。通过这一结构的进一步解析，可以解释真菌免疫调节蛋白所具有的免疫调节功能的本质原因。

本研究成功获得了LZ-8的蛋白晶体，并且获得了3.2 Å的数据，通过进一步蛋白晶体优化，提高晶体各原子相位分辨率，将对晶体结构的解析提供良好的数据，为解释以LZ-8蛋白为代表的真菌免疫调节蛋白的功能以及对该家族蛋白的应用提供了结构基础。

本研究虽然对LZ-8的晶体进行过多次优化，但是都没有提高分辨率。可能原因是LZ-8晶体生长速度太快，使原子没有时间形成有序排列，从而造成分辨率不高。进一步晶体优化过程中，如果能够减慢晶体的生长速度，将有助于原子形成有序排列，从而使分辨率提高。

对重组LZ-8结构的解析确定，将有利于对LZ-8蛋白开展功能机制的进一步研究。同时，这种结构研究方法可以应用于中草药的其他蛋白的结构及功能研究，为我国的中医研究应用提供更多支持。

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Expression and crystallographic studies of a fungal immunomodulatory protein LZ-8 from a medicinal fungusGanoderma lucidum

Min An, George Fu Gao, Jianxun Qi, Feng Li, and Xingzhong Liu

Key Laboratory of Systematic Mycology and Lichenology,Institute of Microbiology,Chinese Academy of Sciences,Beijing100101,China

Received:April 21, 2010;Accepted:May 10, 2010

Supported by:National High Technology Research and Development Program of China (863 Program) (No. 2007AA021506).

Corresponding author:Xingzhong Liu. Tel: +86-10-64807505; E-mail: liuxz@im.ac.cn

国家高技术研究发展计划 (863计划) (No. 2007AA021506) 资助。