人工组合复合菌系分解木质纤维素特征研究

杨梦雅 王云龙 安晓雅 张立强 陈 迪 朴仁哲 崔宗均 赵洪颜*

(1.延边大学 农学院，吉林 延吉 133001； 2.中国农业大学 农学与生物技术学院，北京 100193)

木质纤维素是植物的重要组成部分，在自然界中含量丰富，其结构复杂且稳定，使得木质纤维素难以被直接工业化利用。已有研究从自然界中筛选出很多高效的木质纤维素降解菌种，如里氏木霉(

Trichoderma

reesei

)、绿色木霉(

T.

viride

)、梭菌(

Clostridium

)、芽孢杆菌(

Bacillus

sp

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)等。虽然这些菌种在实验室条件下，能够表现出较好的纤维素分解能力，但是，在自然环境条件下，单一菌株对木质纤维素的降解效果普遍不能令人满意。

近年研究发现复合菌系对木质纤维素的降解有很好的效果，并且都高于单一菌株的生物降解效率。研究表明在自然环境中，木质纤维素的腐解过程也是复合菌系协同作用的结果。有关研究也证明了复合菌系的高效性，崔宗均等培养的纤维素分解复合菌系MC1，8～10 d对水稻秸秆的分解率可以达到99%;王新光等构建的复合菌系对秸秆的降解率最高达到63.6%显著高于单菌株；曹燕篆等筛选出的复合菌系PSD在6 d内对纤维素的分解率达到72%；Vu等筛选的复合菌系能够显著提升纤维素降解酶的活性；Dash等培养的复合菌系对木质素的降解率最高能够达到60%；Srivastava等构建的SNH-1可以使秸秆糖化率提高23%。虽然已从自然环境中筛选出一些高效的复合菌系，但是因为复合菌系的菌落组成多样，并且木质纤维素的生物降解过程较为复杂，这给复合菌系理化特性研究带来挑战。

天然复合菌系PLC-8是本研究团队从腐叶土中提取，并经长期传代培养得到的稳定复合菌系，它能够在20 ℃条件下保持较高的木质纤维素分解能力，30 d对玉米秸秆的降解率为43.65%，但是因为其菌落组成较为复杂，我们没有完全探明其分解木质纤维素的机理。

目前有关木质纤维素降解复合菌系的研究，多数着重于木质纤维素的分解效率，对人工组合复合菌系的可行性以及复合菌系微生物群落动态方面的研究较少，因此，本研究首先对天然复合菌系PLC-8进行简化随后进行人工组合，利用多种方法分离筛选有明显分解效果的菌株，随后组合成3种复合菌系，即复合真菌、复合细菌、真菌与细菌混合菌系，在3种复合菌系分解木质纤维素过程中，分别测定其理化指标以及微生物的群落动态变化，比较其分解木质纤维素效率的差异，并分析真菌与细菌在分解过程中的协同作用，以及真菌与细菌共培养所表现出的拮抗与共存过程的演变，以期为复合菌系及其人工组合相关研究提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

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试验试剂

选用改良察氏培养基。主要成分有：分析纯KHPO1.00 g、MgSO·7HO 0.50 g、(NH)SO1.00 g、FeSO·7HO 0.01 g、KCl 0.50 g、NaNO1.00 g、蒸馏水1 000 mL，调pH 7.2。

牛肉膏蛋白胨琼脂培养基：牛肉膏3.00 g、蛋白胨10.00 g、NaCl 5.00 g、琼脂15.00 g、蒸馏水1 000 mL，pH 7.4～7.6。

PDA培养基：马铃薯粉6.00 g、葡萄糖20.00 g，琼脂20.00 g。

羧甲基纤维素钠培养基：CMC-Na 15.00 g，NHNO1.00 g、酵母膏1.00 g，MgSO·7HO 0.50 g、KHPO1.00 g、蒸馏水1 000 mL。

蛋白胨纤维素培养基：蛋白胨5.00 g、纤维素粉5.00 g、NaCl 5.00 g、CaCO2.00 g、酵母粉1.00 g。

预处理后玉米秸秆：将玉米秸秆切成7 cm长小段，用1.5%的NaOH溶液浸泡24 h，然后用蒸馏水冲洗后浸泡24 h至pH为7.0左右，105 ℃烘干至恒重保存。

本研究所用药品均购自天津市科密欧化学试剂有限公司。

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自然复合菌系筛选、分离和纯化

本研究团队从常年堆积秸秆的腐叶土中取样，经长期连续继代培养，获得的在低温下能分解木质纤维素的稳定复合菌系PLC-8。木质纤维素降解菌株初筛、复筛及富集培养方法参照文献[19]和[20]，将PLC-8复合菌系菌液梯度稀释，采用平板划线法分离纯化单菌株。利用菌株降解滤纸，选择滤纸崩解效果较好的菌株用于后续试验，具体划分参考路鹏等标准，具体过程如下：在100 mL锥形瓶中倒入80 mL的改良察氏培养基，并且放入滤纸条(2 cm×7 cm)，滤纸条贴壁放置，将滤纸条部分浸没在培养液中，定期观察滤纸的崩坏情况。

1.2 人工组合菌系的构建及理化指标的测定方法

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构建人工组合菌系

选择菌株构建复合菌系，编号为N3、N5、N7、N10、N11、P1、P2。其中P1、P2为真菌，其余为细菌，具体分组见表1。在20 ℃、180 r/min条件下震荡培养。

表1 本研究构建的3种复合菌系
Table 1 Three complex strains constructed in this study

复合菌系编号Sample ID菌种组合Combination of strainsF1N3、N5、N7、N10、N11F2P1、P2F3N3、N5、N7、N10、N11、P1、P2

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pH及有机酸含量测定

取样培养液于2 mL离心管中，12 000/(r/min)离心10 min取上清液与乙腈混合，2次离心，利用0.22 μm孔径有机滤膜将溶液过滤，使用高效液相色谱仪(安捷伦科技有限公司)测量有机酸，色谱柱为HITACHI LaChrom C18-AQ(5 μm)，柱温25 ℃，波长210 nm，HSO和NaSO配制溶液作为流动相，流速0.2 mL/min，每次进样量10 μL,具体方法参照文献[18]。

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总重及纤维素成分含量测定

采用失重法，将滤纸烘干并记录重量，将培养液与秸秆用滤纸过滤并烘干，记录总重，去除滤纸重即可得到秸秆重量。将秸秆粉碎过筛，取0.5 g装入滤袋，利用纤维素分析仪(ANKOM 200i，美国安卡姆科技公司)测定木质纤维素各成分含量，具体方法参照文献[22]和[23]。

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木质纤维素分解酶活性测定

分别以滤纸、CMC-Na、微晶纤维素、水杨苷、燕麦木聚糖为底物，缓冲液为KHPO和KHPO4混合配制。采用IUPAC酶活性测定方法测定滤纸酶、内切酶、外切酶、β-葡萄糖苷酶、木聚糖酶酶活性。利用可见光分光光度计在540 nm处测定吸光度。

1.3 人工组合菌系微生物的动态变化测定

使用PCR扩增仪(S1000TM Thermal Cycle，美国Bio-RAD公司)。扩增区域为16S rRNA的V3区和26S rRNA的D1区，细菌采用通用引物对357F-GC和517R，PCR反应条件参考文献[25]。真菌所用引物为NL1-GC和LS2，反应程序参考文献[24]，具体引物序列见表2。

PCR扩增后得到各菌株的基因序列，将所得序列在NCBI上进行BLAST比对分析，并利用MEGA7软件构建系统发育树。变性梯度凝胶电泳(DGGE)在DCodeTM Universal Mutation Detection System分析仪(美国Bio.Rad公司)测定。

表2 本研究所用引物
Table 2 Primers used in this study

引物名称Primer name序列(5′→3′)Sequence (5′→3′)357fGCCTACGGGAGGCAGCAG517rATTACCGCGGCTGCTGG357f-GCCGCCCGCCGCCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGCCTACGGGAGGAGCAGNL1GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAGLS2ATTCCCAAACAACTCGACTCNL1-GCCGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGTCCCGCCGCCCCCGCCCGGCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG

2 结果与分析

2.1 人工组合菌系系统发育树的构建

真菌P1、P2以及细菌N3、N5、N7、N10、N11的18S、16S RNA系统发育树如图1和图2所示。可通过综合分析同源性、可靠性数值和形态特征，初步鉴定菌株P1为漆斑菌属(

Myrothecium

)；P2为青霉属(

Penicillium

)；N3为鞘氨醇单胞菌属(

Sphingomonas

)；N5为黄杆菌属(

Flavobacte

-

rium

)；N7为红球菌属(

Rhodococcus

)；N10为假单胞菌属(

Pseudomonas

)；N11为贪噬菌属(

Variovorax

)。

标尺为1%序列分歧度。 Scale bar: 1% sequence divergence.图1 真菌18S rRNA系统发育树Fig.1 Phylogenetic tree of fungal 18S rRNA

2.2 木质纤维素分解过程中的微生物动态变化

3种菌系的DGGE图谱结果见图3。其中图3(a)为菌系F1、F3的细菌图谱，可知条带1在第15天时消失，条带2、3随着分解过程的进行颜色逐渐变浅，展示这3种条带所代表的细菌菌种的生长受到抑制，并发生优势菌种演替现象，说明细菌群落结构在分解秸秆时发生明显变化。图3(b)为菌系F2、F3的真菌图谱，可知条带没有发生明显变化，展示条带所代表的真菌生长没有受到影响，说明真菌群落在分解过程中保持稳定状态，没有发生群落结构的变化。

2.3 木质纤维素分解过程中的pH变化

图4为3种复合菌系在分解过程中pH的变化情况。可知：3种复合菌系的pH变化有显著的差异：复合菌系F1的pH保持上升状态，没有回复趋势；F2的pH保持下降状态，没有回复趋势；F3的pH最初为7.20，在第10 天下降到6.79，随后回复至7.20左右。有关报道称：分解木质纤维素的复合菌系在分解过程中，pH变化基本上都呈现先下降至微酸性，再逐渐回升至微碱性并保持稳定的规律，该规律是复合菌系具有正常分解能力的表现。因此证明复合菌F3具有正常的木质纤维素分解能力，以及良好的pH自我调节能力。

2.4 木质纤维素分解过程中的挥发性有机酸变化

利用液相色谱法检测玉米秸秆分解过程中5种有机酸(甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、乳酸)的变化。本研究仅检测出甲酸和乙酸，未发现其他有机酸，可能是复合菌系所含菌株具有分解有机酸的能力，能够将丙酸、丁酸、乳酸分解成其他产物。由表3可见：F1处理组在第15天时甲酸含量最高为541.31 mg/L；F2处理组在第20 天时甲酸含量最高为203.08 mg/L；F3处理组第20天时甲酸含量最高为548.58 mg/L。F1在第15天时乙酸含量达到最高值为58.81 mg/L；F2在第20天时达到最高值为59.22 mg/L；F3在第10 天时达到最高值为52.05 mg/L。3种复合菌的甲酸、乙酸含量均呈现先上升后下降的趋势，说明3种复合菌均有不同程度的有机酸分解能力。

标尺：2%序列分歧度。 Scale bar: 2% sequence divergence.图2 细菌16S rRNA系统发育树Fig.2 Phylogenetic tree of bacterial 16S rRNA

图3 DGGE图谱分析结果Fig.3 DGGE profile analysis results

图4 3种复合菌系分解秸秆过程中pH的变化Fig.4 Changes in pH during decomposition of straw by three complex strains

表3 3种复合菌系分解秸秆0～30 d有机酸变化
Table 3 Changes of organic acid from 0 to 30 d for decomposition of straw by three complex strains mg/L

时间/dTime甲酸 Formic acid乙酸 Acetic acidF1F2F3F1F2F30281.03±5.13241.63±5.49281.03±5.1351.53±0.0522.10±0.0351.05±0.055355.08±3.94129.61±2.13130.38±1.8054.10±0.0155.30±0.0739.09±0.0110506.65±7.66124.97±1.39155.14±2.5458.51±0.0239.03±0.0152.05±0.0315541.31±4.95153.92±1.63163.21±1.2058.81±0.0815.67±0.0226.92±0.0220424.55±4.36203.08±1.24548.58±8.5555.60±0.0159.22±0.0939.00±0.0225155.53±5.35172.60±2.04219.20±1.0157.74±0.1159.01±0.0239.93±0.0730124.79±3.83157.64±2.33162.77±1.3053.62±0.0359.31±0.1439.81±0.01

2.5 木质纤维素分解过程中的各组分变化

木质纤维素分解率如图5所示。可知：在处理第30 天时，复合菌系F1处理组的秸秆平均减重为8.19%，半纤维素含量下降12.74%，纤维素含量下降7.3l%，木质素含量下降0.76%；F2的秸秆平均减重为26.78%，半纤维素下降41.53%，纤维素下降14.10%，木质素下降1.16%；F3秸秆平均减重39.80%，半纤维素下降52.64%，纤维素下降25．8%，木质素下降6.26%。可见F1对木质纤维素的降解能力最弱，F3的分解能力最强，可达到天然复合菌系PLC-8降解率的80.00%，因此推断真菌复合菌系对木质纤维素的分解效率大于细菌复合菌系，并且通过合理的人工组合能够大幅度还原自然复合菌系的分解能力。

2.6 木质纤维素分解过程中的多种酶活性变化

由图6可知：F3的酶活性与F1、F2有显著差异，纤维素内切酶、纤维素外切酶、滤纸酶、β-葡萄糖苷酶的活性均呈现先上升后下降的趋势，在第15 天时达到整个过程的最高值，分别为0.089 3、0.081 3、0.085 4和0.068 2 U/mL，随后各种酶活性呈现下降趋势，可能原因是：F3的分解效率相对于F1、F2高，在第15 天时就已经将可直接分解的纤维素分解完全，酶活性因此达到最高值，随着纤维素底物的减少，F3复合菌转向分解木质素等物质，导致纤维素相关酶活性降低。而F1、F2产出酶相对F3少，纤维素的分解效率低，产生的能量不足，抑制菌系的生命活动，导致各种酶活性低于F3。

F1的木聚糖酶活性先上升然后趋于稳定，并且酶活性最大值比F3低，推测原因是F1为细菌复合菌系，缺少其他木质纤维素分解酶。F2木聚糖酶活性大体呈现上升趋势，但是酶活性达到最高点时间比F3晚，可见真菌相较于细菌产出酶种类较为全面，但是产酶效率较F3低。F3在第15天酶活性达到最大值0.114 4 U/mL，在第20 天时酶活性下降，在25 d后呈现上升趋势，可能是因为这一时期半纤维素被消耗完全，木聚糖酶活性下降，真菌分解木质素类有机物。因为木质素被分解，会使更多的半纤维素被暴露出来，木聚糖酶能够直接分解半纤维素，木聚糖酶活性也逐渐升高。

图5 3种复合菌系分解秸秆过程中木质纤维素成分及秸秆总重变化Fig.5 Changes in lignocellulosic composition and total straw weight for decomposition of straw by three complex strains

图6 3种菌系分解秸秆过程中木质纤维素分解酶变化Fig.6 Changes in lignocellulolytic enzymes for decomposition of straw by three complex strains

3 讨 论

相较于从自然环境中分离出的单菌株，人工组合复合菌系可以实现菌株间的协同作用，从而达到更高的纤维素分解效率；并且复合菌系能够自主调节pH，维持相对稳定的环境，解决了单菌株分解木质纤维素时受到产物抑制的问题。本研究通过分离自然复合菌系的菌株，组合成3种复合菌系，并测定3种人工菌系分解木质纤维素效率及产酶情况，结果表明复合菌系对木质纤维素的分解效果优于单菌株，这与已有复合菌系的研究结果相似，例如：崔鸿亮构建的复合菌系与其中的单菌株相比分解率提高22.3%；李阳阳等构建的复合菌系与分解率最高的单菌株相比提高11.2个百分点；江高飞等研究发现通过增加菌系的丰富度，菌系的酶活性也随之增加，并且秸秆的降解效率也呈现正相关关系。

本研究中，简化后的复合菌系F3仅选用了7种菌株，可达到原自然复合菌系分解效率的80%，可见人工简化菌系在减少菌种的同时，也能达到高效的分解效率。李莹等将自然菌系WSC-9简化为菌系F1，10 d可以使水稻秸秆减重73.9%；Kato等通过研究MC1中菌株关系，所组合优化的细菌复合菌系对纤维素有高效的分解能力；Saurabh等简化构建的菌系，酶活性最高可达到8.15 U/mL。

以往有关复合菌系的研究大多是纯细菌复合菌系或者纯真菌复合菌系，例如：Chen等将2种真菌进行组合，所构建的真菌菌系在最佳条件下木质素和纤维素的降解率为26.38%和33.29%；Kaur等构建的真菌菌系，72 h对纤维素的降解率为56.4%；Poszytek等构建的MCHCA细菌复合菌系能够有效降解木质纤维素；Matthews等利用30种细菌构建的细菌复合菌系对稻草有明显的降解效果。而在Datsomor等研究发现，构建的真菌复合菌系没有达到预期的协同效果，反而出现竞争拮抗作用，这说明菌株之间并不是完全处于协作的关系。

细菌与真菌的相互作用是许多生态系统功能的重要驱动因素，其协同作用或者拮抗作用能够导致微生物发生许多特性变化。一般情况下，利用相同资源生存的不同物种之间大多呈现竞争关系，经过长期的共存培养后，不同物种可以依靠基因的突变来达到共存状态。对于自然环境中的微生物群落来说，土壤理化性质和环境因素，往往限制了真菌和细菌的分布以及他们的相互作用程度，即使从同一土壤样本中所分离出的菌株，也存在拮抗或者共存2种可能，人为选择不同菌株并构建复合菌系可能存在更多的不确定性。李静等从林下土壤中筛选构建的复合菌系在增加细菌多样性的同时，分解秸秆的能力甚至有所下降；魏蔚等研究发现，复合菌系中的菌种从4种增加到7种，降解能力反而减弱；王小娟等利用从枯叶土壤中筛选出的菌株，构建的WSD-5复合菌系可以使麦秆中的纤维素成分减少94.2%；吕育才等将纤维素降解细菌CTL-6与无纤维素降解作用的W2-10细菌共培养，显著提高了CLT-6的酶活性和降解能力；华彬彬等将纤维素降解细菌CSK1与其他4种无纤维素降解能力的细菌构建菌系，发现在秸秆降解前期0～9 d，菌系表现出明显的协同作用，但是在分解后期菌系受到pH的影响，抑制了菌系的分解能力。在自然环境所分离出的微生物群落中，能够找出互相之间有互利作用的真菌和细菌，并对其进行组合，那么就可以构建出稳定的复合菌系。例如：梅新兰等利用4种菌株构建的真菌-细菌复合菌系比其余丰富度的菌系分解效率最高提升1.6倍；张必周等构建的真菌-细菌复合菌系酶活性可达85%以上，秸秆降解率最高可达38.79%；侯敏等筛选构建的真菌-细菌菌系能够显著提高降解效果。

本研究所构建的复合菌系在分解纤维素后期发生了明显的群落组成变化：在细菌与真菌共培养过程中，有2种细菌的DGGE图谱消失，1组条带变暗，而其他条带保持稳定状态。分析原因，复合菌系F3所使用的菌株之间具有拮抗和互利2种作用，在培养过程中菌系通过自身的群落动态演化，淘汰了其中某些弱势菌种，存活下来的菌株则呈现出互利共存的行为，从而进化到相对稳定的状态，并且能够稳定分解木质纤维素，产酶种类丰富，酶活性也较高，说明复合菌系F3实现了稳定的真菌-细菌共存体系。

4 结 论

本研究从自然菌系PLC-8中分离筛选出细菌N3、N5、N7、N10、N11；真菌P1、P2。并将其组合成细菌、真菌、真菌-细菌3种复合菌系。设置秸秆降解试验，测定木质纤维素的降解率，并利用DGGE法分析微生物的群落结构，主要研究结论如下：

1)自然复合菌系PLC-8在经过简化后，仍然能够保持稳定的木质纤维素分解能力。

2)人工组合复合菌系F3，是一种稳定高效的木质纤维素降解菌系，其分解效率高于F1、F2，在分解过程中能够保持pH的相对稳定，并且具有分解产物中有机酸的能力。

3)在分解木质纤维素过程中，细菌发生明显群落结构变化，真菌不发生变化。在F3中，细菌与真菌可以实现协同作用，并长期保持稳定状态。