替硝唑注射液细菌内毒素检查法的可行性研究

焦小丽 黄新兰* 季红兰 陈琴华

江苏省扬子江药业集团有限公司（225321）

替硝唑注射液为抗厌氧菌及灭滴虫药，临床主要用于治疗滴虫、肠及肠外阿米巴病、贾第虫病和厌氧菌感染。替硝唑注射液在《中国药典》2005 版中采用家兔法检查热原[1]，但家兔法操作繁琐费时，而且实验成本高，不适用于注射剂生产过程中的质量监控。本实验根据鲎试剂在没有干扰条件下可以对样品进行细菌内毒素检查的原理，参照《中国药典》2005 版中的细菌内毒素检查法，采用凝胶法鲎试验法，通过干扰实验确立了替硝唑注射液的细菌内毒素检查法，并与家兔法进行对照，实验结果表明细菌内毒素检查法准确可靠、操作方便简单，可以用细菌内毒素检查法代替家兔法控制替硝唑注射液的热原[2]。

1 仪器与试药

2H-2型漩涡混合器（天津药典标准仪器厂）；TAL-3A型干式恒温器（南京三爱斯技术开发有限公司）；LC-233B1型高温干燥箱。细菌内毒素标准品（批号为150601-200862，120EU/支，中国药品生物制品检定所）。鲎试剂（TAL，批号为0810222，0.25EU/支，0.1mL/支，湛江安度斯生物有限公司；批号为0809200，0.25EU/支，0.1mL/支，湛江博康海洋生物有限公司）。细菌内毒素检查用水（BET水，批号为0806300，25mL/瓶，湛江安度斯生物有限公司）；热原合格的替硝唑注射液（规格：200mL：0.8g，批号：08090611、08090811、08090911扬子江药业集团南京海陵药业有限公司）。

2 方法与结果[3-13]

2.1 细菌内毒素限值L确定

公式L=K/M中L为细菌内毒素限值；K为按规定的给药途径，人用每千克体质量每小时最大可接受的内毒素剂量，注射剂为5EU/(kgh)[1]；M为每小时内每千克体质量（人）的最大给药剂量，或热原检查家兔按规定给药途径的给药剂量，2005年版《中国药典》规定家兔剂量为8mL/kg，因此可算得L=5/8=0.625EU/mL。

2.2 最大有效稀释倍数的确定

根据公式MVD=cL/λ，L为供试品的细菌内毒素限值，c为供试品溶液的浓度，λ为鲎试剂的标示敏感度。2005年版《中国药典》规定当L以EU/mL表示时，c为1.0mL/mL。L=0.625EU/mL，λ为0.25EU/mL，则MVD=2.5。

2.3 细菌内毒素检查用水（BET）的质量考察

实验中使用的细菌内毒素检查用水（内毒素含量＜0.015EU/mL）经检查，在37℃试管恒温仪中放置4h未与鲎试剂产生凝聚反应，符合中国药典规定[2]。

2.4 TAL敏感度复核

所用TAL按2005年版《中国药典》规定进行敏感度复核。结果均在0.5～2λ，符合规定，故可用于细菌内毒素的检查。

2.5 干扰预试验

选用λ=0.25EU/mL的TAL，以原液作为基准，用BET水对样品进行倍比稀释，得样品的稀释倍数系列（即原液，1∶2、1∶4、1∶8、1∶16），以此系列为NC系列。PC系列：用原液和供试品各稀释液将细菌内毒素标准品稀释成与上述NC系列相同的稀释倍数系列，但在稀释过程中每稀释倍数中都会有2λ内毒素。选择两个厂家的标示量为0.25EU/mL的TAL，使之分别与上述两个系列反应，同时作阳性对照和阴性对照，结果见表1。结果表明：样品溶液稀释倍数在1∶2以下时不干扰试验。

2.6 干扰试验

采用两个厂家0.25EU/mL的TAL，用替硝唑液注射液的1∶2稀释液和BET水将同一细菌内毒素工作标准品分别制成2.0、1.0、0.5、0.25λ的系列浓度溶液，考察本品对细菌内毒素检查法的干扰情况，结果见表2。Es值在0.5～2.0λ，且Et值在0.5Es～2.0Es，说明此时样品稀释对细菌内毒素检查无干扰。

表1 供试品干扰试验预试验结果

表2 供试品的干扰试验结果

表3 3批替硝唑注射液的细菌内毒素检查结果

2.7 样品中细菌内毒素检查

按2005年版《中国药典（二部）》附录规定的方法，对3批样品按1∶2稀释后，以λ为0.25EU/mL的TAL进行常规的细菌内毒素检查，结果见表3。结果表明，3批替硝唑注射液的细菌内毒素均小于0.5EU/mL，与热原法结果一致。

3 讨 论

本试验采用不同厂家的TAL对3个批号样品进行凝胶法细菌内毒素检查，结果符合2005年版《中国药典》附录有关规定，排除了采用了不同厂家TAL对本试验带来的影响，且供试品用热原检查法检测也均符合规定。因此，可认为用细菌内毒素检查法检测替硝唑注射液中的细菌内毒素是可行的，并可确定其细菌内毒素限值为0.5EU/mL。

[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典(二部)[M] .北京：化学工业出版社,2005：XIE86.

[2] 叶明,纪绿波.细菌内毒素及其检查法的研究[J] .广东药学,2003,13(2)：28-29.

[3] 吴扬,赵云燕.细菌内毒素检查法的应用进展[J] .安徽医药,2004,8(3)：226-227.

[4] 黄清泉,刘文英,丁黎.热原及其检查方法的研究进展[J] .中国新医药,2004,2(2)：1-4.

[5] 杨忠思,吴振军,杜滨.热原和细菌内毒素检查研究进展[J] .医学综述,2005,11(2)：142-144.

[6] 司增银,姜隆梅,于成军,等.兔法与鲎试剂法检测大输液热原控制标准探讨[J] .泰山医学院学报,1994,15(3)：170-171.

[7] 舒达利.鲎法检查细菌内毒素的实验探讨[J] .中华实用中西医杂志,2006,19(8)：967-968.

[8] 林彩,贺俊英,次旦扎西,等.替硝唑注射液的细菌内毒素检查[J] .中国新医药,2003,2(7)：35-36.

[9] 张永坚,冯聚锦.鲎试剂在药品生产过程细菌内毒素控制上的应用[J] .医药工程设计杂志,2003,24(10)：11-14.

[10] 纪国力.凝胶法在细菌内毒素检查中常见的干扰因素和处理[J] .社区医学杂志,2008,6(9)：84-85.

[11] 王欣放,王晓雷.凝胶法细菌内毒素检查中的有关注意事项[J] .中国医药导报,2007,4(36)：249.

[12] 林郁,焦志铁,沈素琴.细菌内毒素检查方法综述[J] .时珍国医国药,2006,17(8)：1575-1576.

[13] 盈坤,房霞,雷光.细菌内毒素检查法中应注意的问题[J] .医药导报,2006,25(11)：1217-1218.