脂蛋白脂酶基因 Ser447stop多态性与脑出血的关系

林慧琼, 李吕力, 刘晓春, 钟维章, 滕晓茗, 罗永坚, 张德敏

研究提示,Ser447Stop是一种保护性因素,具有抑制冠心病发展的作用[1]。研究表明,脂蛋白脂酶(lipoprotein lipase,LPL)基因 Ser447→终止密码突变(Ser447Stop)多态性在动脉粥样硬化形成中发挥重要作用。我们的研究发现,脂蛋白脂酶Ser447stop多态性与脑梗死发病有一定相关性,G等位基因是脑梗死的一个保护性因素[2]。本研究应用聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)和限制性片段长度多态性方法(restiction fragment length polymorphism,RFLP),研究 LPLSer447Stop多态性与脑出血相关性,通过比较 Ser447Stop等位基因在脑出血组(CH)组和对照组中的频率,探讨 LPL Ser447Stop突变与 CH是否存在相关性,为 CH的预防和基因治疗提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 资料

脑出血组：脑出血患者共 69例,为广西壮族自治区人民医院神经内科患者,以全国第四届脑血管病学术会议诊断标准(1986)为诊断依据,经头颅CT或 MRI证实,其中,男性 51例,女性 18例,平均年龄 57.12±11.61岁。以上病例均排除糖尿病、严重肾、肝疾病、甲状腺疾病等。66例正常对照者由健康体检者中选出,其中男性 46例,女性 20例,平均年龄 53.86±15.71岁,血脂、血糖正常者,排除心脑血管疾病、高血压病、甲状腺疾病及糖尿病。两组研究对象的基本条件互相匹配,具有可比性。空腹12h后,抽静脉血 3m l,留取血清置 -80℃保存;抽静脉血 3ml,ACD抗凝,置 -20℃保存。

dNTPs、TaqDNA聚合酶、MnlI限制性内切酶(上海生工生物工程有限公司);Ser447stop RFLP引物由上海生工生物工程有限公司合成;甘油三酯(TG)、总胆固醇 (TC)、HDL-c、LDL-c(日本协和药品株式会社)、Lp(a)、ApoAⅠ、ApoB100(中生北控公司)、PE5700扩增仪、ADVIA1650全自动生化分析仪。

1.2 方法

1.2.1 血清脂质的检测 将所收集的血清标本解冻后 1h内完成检测。酶法测定 TC和TG,选择性遮蔽法直接测定高密度脂蛋白胆固醇(HDL-c),直接测定法低密度脂蛋白胆固醇(LDL-c),免疫比浊法测定 ApoAⅠ、ApoB100。以上均为 ADVIA1650全自动生化分析仪进行。

1.2.2 PCR-RFLP法进行基因分型 (1)外周全血白细胞 DNA的抽提：采用酚/氯仿法抽提DNA,用双蒸水溶解,-20℃保存。(2)RFLP扩增：PCR反应体系为：10×buffer 4μl,4×2mmol/L dNTPs 4μl,引物序列参照文献[1],5pmol/μl Primer混合物 4μl,2.5U/μl TaqDNA聚合酶 0.6μl,DDW 25.4μl,DNA 2μl,以上操作均在冰浴上进行。PCR反应条件：94℃预变性 5m in,94℃ 60s,57℃ 60s,72℃60s共 30循环,72℃ 10min。反应结束后用1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测特异性 PCR扩增产物。(3)扩增产物酶切及基因型判断：取 PCR扩增产物 10μl加 MnlI限制性内切酶 2.5U,总反应体积20μl,37℃水浴 4h,水浴结束后 56℃ 20min以终止反应;取酶切产物 10μl和 6×上样缓冲液 2μl进行2%琼脂糖凝胶电泳,紫外透射仪下观察结果。扩增产物长 488bp,经 Mn lI限制性内切酶水解后出现 3种多态性：LPL Ser447stop无突变(CC)型(285bp,203bp);LPL Ser447stop突变杂合子 (CG)型(285bp,246bp,203bp);LPL Ser447stop无突变(GG)型(246bp,203bp)。

1.2.3 统计学方法 基因型采用频率计数法,用 Hardy-Weinberg平衡定律计算出等位基因频率。组间基因型及等位基因频率比较采用 χ2检验。病例组与对照组间、不同基因型间血清脂质比较采用单因素方差分析。以上各检验均采用 SPSS 12.0统计软件包进行统计分析。以 P＜0.05表示差异有显著性统计学意义,以 P＜0.01表示差异有极其显著性统计学意义。

2 结 果

2.1 脑出血组与对照组 Ser447stop基因型和等位基因频率分布 见表1。

2.2 脑出血组与对照组血脂和载脂蛋白含量水平比较 见表2。

2.3 对照组不同 LPL Ser447stop基因型血脂和载脂蛋白含量水平比较 见表3。

表1 脑出血组与对照组Ser447stop基因型和等位基因比较

表2 脑出血组与对照组血脂和载脂蛋白含量(±s)比较

表2 脑出血组与对照组血脂和载脂蛋白含量(±s)比较

与对照组相比,脑出血患者组血清TG、LDL-c水平升高(P＜0.01);脑出血组患者血清CHO、ApoAⅠ、ApoB水平降低(P＜0.01)

对照组(66例) 脑出血组(69例) t值 P CHO(mmol/L)TG(mmol/L)HDL-c(mmol/L)LDL-c(mmol/L)ApoAⅠ(g/L)ApoB(g/L)Lpa(mg/L)5.1305±0.2888 1.0268±0.3352 1.046±0.1809 1.7930±0.2238 1.2053±0.1353 1.2638±0.1863 242.45±242.59 4.3004±0.9040 1.6401±1.5323 1.094±0.3572 2.7216±0.8565 1.0907±0.2136 1.0103±0.2920 263.32±234.36 7.25 3.245 1.000 8.68 3.70 6.03 0.508 0.000 0.002 0.320 0.000 0.000 0.000 0.612

表3 对照组不同LPL Ser447stop基因型血脂和载脂蛋白含量(±s)比较

表3 对照组不同LPL Ser447stop基因型血脂和载脂蛋白含量(±s)比较

对照组内 CC基因型与 CG基因型 HDL-c具有显著性差异(P＜0.05),其它血脂含量无显著性差异

CC型(40例) CG型(26例) t P CHO(mmol/L)TG(mmol/L)HDL-c(mmol/L)LDL-c(mmol/L)ApoAⅠ(g/L)ApoB(g/L)Lpa(mg/L)5.15±0.34 0.96±0.34 1.08±0.17 1.81±0.23 1.20±0.12 1.26±0.21 252.2±252.9 5.08±0.14 1.11±0.31 0.98±0.18 1.74±0.19 1.21±0.16 1.26±0.14 229.2±233.2 1.17 1.85 2.25 1.35 0.27 0 0.379 0.272 0.084 0.033 0.228 0.641 0.961 0.363

3 讨 论

动脉粥样硬化(AS)引发的脑血管疾病,是严重危害人类健康及生命的主要疾病。在形成动脉粥样硬化过程中,血脂代谢异常起重要作用。由于 LPL参与脂质代谢,而脂代谢与动脉粥样硬化密切相关,因此一些学者将 LPL基因作为心血管疾病和糖尿病的候选基因之一进行研究。人脂蛋白脂酶基因位于染色体 8q22,全长 30kb,由 10个外显子和 9个内含子组成。已发现 LPL存在数十种基因变异,LPL Ser447stop突变是 LPL常见变异之一,LPLS-er447Stop突变频率较高,在某些研究中其杂合子频率可达 17%～22%[3]。Ser447stop突变是外显子 9中第 1595位核苷酸 C→G,导致第 447位 Ser变为终止密码子,从而使 LPL蛋白的 C末端缺少 2个氨基酸 Ser和 Gly。

本研究提示正常广西地区人群 LPL Ser447stop C等位基因含量为 80.30%,G等位基因含量为19.70%;与滕亚娟等[4]报道中国青岛地区人群相比分布基本一致,其 LPL Ser447stop等位基因 C等位基因含量为 80%,G等位基因含量为20%;与 Shimo-Nakanishi[5]的日本人群相比,C等位基因含量较高(84.2%),G等位基因含量较低(15.8%),说明 LPL Ser447stop等位基因频率分布可能存在种属差异。研究结果提示,与对照组相比,脑出血患者组 CG基因型含量较对照组少(P=0.008,χ2=6.93);脑出血患者组 G等位基因含量较对照组少(P=0.016,χ2=5.766);提示 LPL Ser447stop多态性与脑出血发病有一定相关性,G等位基因是脑出血的一个保护性因素。LPLSer447stop突变对脑出血具有保护作用的机制尚不清楚,可能与 LPL功能有关。最近 Clee等[6]和 Sass等[7]的研究表明,LPL Ser447stop基因变异很可能是血管保护因素,具有改善内皮功能和防止内皮功能失调的作用,因此有利于防止动脉粥样硬化的发生。颈动脉粥样硬化是脑出血的重要危险因素,据报道 20%～30%的脑卒中是由于颈动脉狭窄性病变进行性发展所致。Shimo-Nakanishi等[5]的结果显示合并颈内动脉粥样硬化性狭窄的脑卒中患者,G等位基因频率较低,比不合并颈内动脉狭窄的脑卒中患者 G等位基因携带率还要低,提示 LPL Ser447 stop对脑出血的保护作用部分源于它对颈动脉粥样硬化的阻抑作用。此外,LPL基因变异也可能通过转运胆固醇的维生素 E到神经元,从而有助于受损神经细胞膜的再生,因而还有保护脑细胞的作用[8]。

LPL突变可能影响其催化功能,造成以三酰甘油水平升高为主要特征的严重高乳糜微粒血症,并出现一系列临床症状。LPL导致的高三酰甘油血症与动脉粥样硬化的关系尚未被广泛证实。既往研究表明,Asp9Asn、Asn291Ser、Gly188Glu和其他一些罕见突变通常与血浆高甘油三酯及早发性冠心病(CAD)呈正相关。最近有资料提示 Ser447Stop突变是一种保护性因素,能抑制 CAD的发展,Ser447Stop突变携带者,与三酰甘油水平降低有关,对男性 CAD患者有保护作用[9]。本研究结果提示,脑出血患者组血清 TG、LDL-c水平较对照组升高(P＜0.01)。脑出血组患者组血清 CHO、ApoAⅠ、ApoB水平较对照组降低(P＜0.01);对照组内 CC基因型与 CG基因型 HDL-c具有显著性差异(P＜0.05),其它血脂含量无显著性差异。

国内有关 LPL Ser447stop基因多态性与脑出血的相关性的研究目前还鲜有报道,今后的研究需扩大研究地域与研究人群,通过大规模的样本研究,进一步证实和明确 LPL Ser447stop基因与脑出血发生发展的关系。

[1]Garenc C,Perusse L,Gagnon J,etal.Linkage and association studies of the lipoprotein lipase genewith postheparin plasma lipase activities,body fat,and plasma lipid and lipoprotein concentrations：the HERITAGE Fam ily Study[J].Metabolism,2000,49(4)：432-439.

[2]刘晓春,林慧琼.脑梗死患者脂蛋白脂酶基因 Ser447stop多态性分析[J].现代检验医学杂志,2008,23(5)：32-34.

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[4]滕亚娟,张晨.脂蛋白脂肪酶基因 Ser447stop多态性与缺血性脑血管病的关系[J].实用医药杂志,2006,23(2)：131-135.

[5]Shimo-Nakanishi Y,Urabe T,Hatton N,etal.Polymorphism of the lipoprotein lipase gene and risk of atherothrombotic cerebral infarction in the Japanese[J].Stroke,2001,32(7)：1481-1486.

[6]Clee SM,Loubser O,Collins J,etal.The LPL S447X cSNP isassociated with decreased blood pressure and plasma triglycerides,and reduced risk of coronary artery disease[J].Clin Genet,2001,60(4)：293-300.

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