柱前衍生HPLC法测定水蛭提取物中氨基酸的含量

刘相辉，裴福成，任桂萍，杨柳

(1.哈尔滨市食品药品检验检测中心，黑龙江 哈尔滨 150028;2.哈药集团中药二厂，黑龙江 哈尔滨 150078;3.东北农业大学，黑龙江 哈尔滨 150030;4.黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040)

水蛭为水蛭科动物蚂蟥 (Whitmania pigra Whitman)、水蛭(Hirudo nipponica Whitman)或柳叶蚂蟥(Whitmania acranulata Whitman)的干燥全体。具有破血，逐瘀，通经之功效［1］。主含蛋白质、多肽、氨基酸类［2］。前期试验中，我们曾采用柱前衍生法测定了地龙中的氨基酸含量［3］，收到了较好的效果。本实验采用同样的测定方法进行了水蛭提取物中游离氨基酸和水解总氨基酸的含量测定研究，为水蛭的质量评价提供依据。

1 仪器与试剂

Agilent 1100系列高效液相色谱仪:1311A四元梯度泵，1313A自动进样器，1315A二极管阵列检测器(DAD)。

17种混合氨基酸标准品、硼酸盐缓冲液、邻苯二甲醛(OPA)试剂及9－芴甲基氯甲酸酯(FMOC)均由Agilent公司提供;甲醇、乙腈(色谱纯)，其他试剂均为分析纯，超纯水。

水蛭(蚂蟥)药材购于安国药材公司。

2 液相色谱条件

色谱柱:AgilentZOBAX Eclipse－AAA柱(4.6mm ×150mm，3.5μm)，流动相 A:40mM NaHPO4 pH 7.8;B:乙腈 －甲醇 －水=45:45:10(V/V/V)，流速2mL·min－1。梯度程序见表1。

检测器设置:检测波长:338nm，带宽10nm;参比波长:390nm，带宽20nm;14.6min后检测波长:262nm，带宽16nm;参比波长:324nm，带宽8nm;柱温:40℃。

进样:样品与衍生剂(OPA和FMOC)用自动程序反应后进样。

表1 梯度洗脱程序表

图1 氨基酸分析HPLC图谱Fig.1 HPLC chromatograms of amino acids

3 实验方法与结果

3.1 水蛭提取物的制备

称取水蛭粗粉5g，加水30mL，浸泡60min，超声处理(250W，50Hz)60min，离心(12000 r·min－1)10min，取上清液，备用。

3.1.1 完全酸水解氨基酸样品制备

精密量取水蛭提取物溶液1.5mL，加6 mol·L－1盐酸10mL，抽真空脱气，N2密封保护，在110℃下水解24h，冷却后打开水解管，转移至蒸发皿中，水浴挥干盐酸，再用水洗数次，彻底挥干盐酸，用0.1mol·L－1盐酸溶解，并定容至 10mL，0.45μm 滤膜滤过，滤液备用。

3.1.2 游离氨基酸样品制备

精密量取水蛭提取物溶液3.0mL，加入乙腈9.0mL，摇匀，0.45μm滤膜滤过，残渣加适量乙腈溶液(乙腈－水=3∶1，v/v)洗涤，滤膜滤过，合并滤液，减压挥干溶剂，用 0.1mol·L－1盐酸溶解，并定容至10mL，0.45μm滤膜滤过，滤液备用。

3.2 工作曲线的绘制

将17种混合氨基酸标准品(浓度为1nmol·μL－1) 用 0.1mol·L－1盐酸依次稀释成 0.750、0.500、0.250、0.100nmol·μL－1，进行衍生和分析。结果，在试验浓度范围内，除脯氨酸线性关系相对较差外(r=0.996)，其余16种氨基酸的线性相关系数均在0.999以上(n=5)。

3.3 精密度试验

用混合氨基酸标准品溶液重复进样5次，结果17种氨基酸的出峰时间及峰面积RSD均在0.9%以内。

3.4 重复性试验

制备完全酸水解氨基酸样品和游离氨基酸样品各6份，分别进行氨基酸含量测定，结果酸水解总氨基酸(mg·g－1)分别为 29.04，29.71，29.13，30.29，29.96，30.09，平均为29.70，其 RSD值为1.74%;游离总氨基酸(mg·g－1) 结果分别为 10.69，11.08，10.85，11.03，11.26，11.17，平均为 11.01，其 RSD 值为1.91%。

3.5 回收率试验

采用混合氨基酸标准品溶液加入法进行试验，结果完全酸水解总氨基酸平均回收率为98.3%，RSD为2.07%;游离总氨基酸平均回收率为97.7%，RSD为2.14%。

4 讨论

4.1 用水解总氨基酸含量减去游离氨基酸含量可间接得到水蛭提取物中抗凝溶栓活性蛋白及多肽类成分的含量。

4.2 在游离氨基酸测定过程中，为避免大分子蛋白类物质对色谱柱产生污染，除采用常规的保护色谱柱外，我们采用乙腈沉淀法对提取液进行预处理。试验结果证实，样品溶液与乙腈比例为1∶3(v/v)时，处理效果最佳。

4.3 水蛭提取液中各种氨基酸的含量差别很大。因此，用等摩尔浓度的混合标准品溶液所作的校正曲线，其线性范围不能涵盖所有的氨基酸，建议最好根据实际样品中各氨基酸的具体含量情况配制不同浓度的混合标准品溶液来作校正曲线。

4.4 在试验条件下，游离氨基酸样品和水解总氨基酸样品中均没有检测出CY2(胱氨酸)，但均检测到HYP(羟脯氨酸)，由于没有供含量测定用对照品，因此未对其含量进行测定。

［1］ 国家药典委员会.中华人民共和国药典［M］.北京:化学工业出版社，2005.

［2］ 黄荣清，孙晓东，李艳玲，等.水蛭的研究进展［J］.中西医结合学报，2004，2(5):387 －389.

［3］ 裴福成，李长新，任桂萍.柱前衍生HPLC法测定地龙中氨基酸的含量［J］.中医药学报，2007，35(3):26 －27.