肾白宁对大鼠糖尿病肾病模型细胞凋亡及对 Bax，Bcl－2 的影响

黄吉峰，金祈卓，刘丽燕，王名蓂，李显筑 (指导)

(1.黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040;2.黑龙江省中西医结合研究所，黑龙江 哈尔滨 150090)

糖尿病肾病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病代谢异常引起的肾小球硬化造成肾功能损害和障碍，是糖尿病最常见而又最难治的微血管并发症，可增加心血管事件的发生率与死亡率，是糖尿病患者致残与死亡的重要因素之一［1］。近年来的研究表明，细胞凋亡与DN发生密切相关，为进一步揭示DN的发病机理及中药肾白宁的作用机制，我们开展了肾白宁对DN细胞凋亡影响的研究，现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 药物 肾白宁:由哈尔滨世一堂研究所配制成浸膏(药物组成:黄芪50g，熟地黄20g，山药15g，山茱萸15g，牡丹皮 15g，茯苓 25g，泽泻 15g，桑螵蛸 35g，水蛭10g，白花蛇舌草45g，当归15g，益母草15g等);洛汀新 (贝那普利，北京诺华制药有限公司，批号:X1266)。

1.2 实验方法

1.2.1 实验动物 清洁级健康SD雄性大鼠(200～240g)60只。

1.2.2 糖尿病肾病模型的建立 动物适应性喂养1周后开始实验。随机取15只为假手术组，假手术组大鼠在腹腔麻醉状态下，背部切口，剥离左肾脂肪包膜，关闭缝合切口。其余大鼠腹腔麻醉下进行左侧肾脏切除术，术后恢复2w。将STZ溶于0.1mol·L－1柠檬酸缓冲液(pH4.4)中，避光条件下迅速配成浓度为1%STZ溶液。动物禁食12h后，按照50mg·kg－1剂量，予以STZ腹腔注射;72h后，尾静脉取血，测定空腹血糖，空腹血糖≥16.7mmol·L－1作为 DN大鼠成模标准。

1.2.3 分组与给药 造模成功后大鼠随机分为模型组、中药组、对照组及假手术组各15只，共60只。各组自造模成功第1d起开始给药。假手术组，模型组:给予每日1次1mL蒸馏水灌胃;中药组:将肾白宁浸膏溶于生理盐水，配制成混悬液，以2.97g·kg－1灌胃，每日1次;对照组:洛汀新(贝那普利)溶于生理盐水，配制成混悬液，0.9mg·kg－1灌胃，每日1次。均给药12w，每2w称重调整剂量。给药期间每组大鼠分笼饲养，随意饮水，食用标准动物饲料。

1.2.4 观察指标及检测方法

采用原位末端标记法检测细胞凋亡，Bax，Bcl－2检测采用免疫组化的方法，并使用图像采集系统测定阳性反应面积，每张切片随机选取五个视野，每组分析15个标本。此项内容由黑龙江中医药大学附属第一医院病理科帮助完成。

1.3 统计学处理

2 结果

12w后光镜下可见模型组肾小球毛细血管球萎缩，球囊腔略增大，肾小球出入球小动脉有轻度内皮细胞增生及纤维化，基底膜略增厚，远曲小管扩张，肾间质充血，水肿，血细胞浸润，并有轻度间质纤维化。模型组，中药组，对照组细胞凋亡阳性表达较假手术组高，有显著性差异(P<0.01);中药组，对照组与模型组比较阳性表达低(P<0.01);中药组与对照组无明显差异(P>0.05)。肾小球中Bax，Bcl－2表达各组几乎为阴性，肾小管中Bax，Bcl－2表达假手术组显著低于其他三组(P<0.01);中药组，对照组与模型组比较Bax阳性表达低(P<0.01)，而Bcl－2表达高(P<0.01);中药组与对照组比较无明显差异(P>0.05)，结果见表1。

表1 各组肾组织细胞凋亡及Bax，Bcl－2表达情况(±s)

表1 各组肾组织细胞凋亡及Bax，Bcl－2表达情况(±s)

注:与假手术组比较，*P<0.01，与模型组比较，△P<0.01。

组别 n 细胞凋亡Bax Bcl－2假手术组15 8.69±0.56 10.03±0.74 8.98±1.85模型组 15 42.48±0.61* 39.38±3.07* 23.03±0.85*中药组 15 24.17±0.81*△ 26.42±0.71*△ 37.16±1.92*△对照组 15 25.52±0.64*△ 26.17±0.92*△ 35.95±0.97*△

3 讨论

细胞凋亡是指细胞在一定的生理或病理条件下，遵循自身的程序，自己结束其生命的过程，最后细胞脱落离体或裂解为若干凋亡小体，被其他细胞吞噬［2］。

细胞凋亡是受基因调控的一种主动连续的程序化反应，Bcl－2蛋白的生理功能主要是抑制细胞凋亡，延长细胞寿命，而不影响细胞周期和分化［3，4］。Bax是拮抗Bcl－2的促凋亡因子，它是Bcl－2结合蛋白，并与其有同源序列。Bcl－2的过剩有助于细胞存活，而Bax 的过剩有助于细胞死亡［3，4］。

Ortiz等［5］研究发现，高糖浓度促进了凋亡调节基因Bcl－2的表达下调及Bax基因表达的上调，促进近端小管上皮细胞凋亡。同时体内研究表明，在糖尿病db/db鼠肾皮质Bcl－2基因表达下降，Bax基因表达上调，与非糖尿病db/m鼠比较，前者变化与凋亡指数相关。

本实验结果显示，中药组细胞凋亡数明显少于模型组，与对照组无显著性差异。肾白宁通过抑制Bax表达，上调Bcl－2表达而起到了抑制肾组织细胞凋亡的作用，保护了肾功能，延缓了DN的进展。

［1］ 马艳春，周波，张立净，等.中药治疗糖尿病肾病的作用机制研究进展［J］.中医药学报，2009，37(6):105 －108.

［2］ 溫进坤，韩梅.医学分子生物学理论与研究技术［M］.第2版.北京:科学出版社，2002:244－261.

［3］ White E.Life，death，and the pursuit of apoptosis［J］.GenesDev，1996，10(1):1 －15.

［4］ 赵燕，杨秋萍.糖尿病肾病与细胞凋亡及其相关基因研究进展［J］.医学综述，2007，13(12):911 －913.

［5］ Ortriz A，Ziyadeh FN，Neilson EG.Expression of apoptosis－regulatory gene in renal proximal tubular epithelial cellsexposed to high ambient glucose and in diabetic kidneys［J］.Invest Med，1997，45(2):50 －56.