蝙蝠葛酚性碱对胰腺癌瘤组织中K－ras蛋白表达的影响

冯大志，白云，闻喜英，王家明，苏云明

(1.哈药集团制药六厂，黑龙江 哈尔滨 150025;2.黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040;3.牡丹江医学院第二附属医药，黑龙江 牡丹江 157009;4.哈药集团三精制药股份有限公司，黑龙江 哈尔滨 150010)

胰腺癌的发病率有明显的地区差异，在发达国家和工业化程度较高的国家，其发病率较高，而非洲和亚洲国家的发病率较低。半个多世纪来，英、美等国家的发病率逐步上升。胰腺癌居常见癌症死因的第4位，居消化道癌症死因的第2位，仅次于大肠癌［1］。现代医学对胰腺癌的病因研究尚未完全清楚，可能与胰腺癌发病的有关因素包括吸烟、高热量、高胆固醇、高碳水化合物摄入性饮食、慢性胰腺炎、糖尿病、胃溃疡和胃切除术、胆囊切除术和胆石症、环境污染、遗传因素(包括家族性胰腺癌、Ⅰ型多发性内分泌肿瘤综合征、遗传性胰腺炎、Ⅱ型Lynch综合征、共济失调－毛细血管扩张综合征、家族性非典型性多发性痣黑素瘤综合征等)。目前研究认为，癌基因和抑癌基因(如K－ras、DPC4、P16、P53 等)、细胞凋亡、端粒酶、肿瘤新生血管的形成等在胰腺癌的发生中起重要作用［2］。

1 实验材料

1.1 实验动物

裸鼠48只，体重(20±2)g，雌雄各半，由黑龙江中医药大学药物安全性评价中心提供，合格证:SCXK(京)2007－0001。

1.2 实验瘤株

胰腺癌瘤株(BXPC－3)购自中国科学院上海生命科学院细胞资源中心。

1.3 动物饲养

在黑龙江中医药大学药物安全性评价中心饲养。

1.4 药物

蝙蝠葛酚性碱(PAMD)由黑龙江中医药大学药学院王栋教授提供，用时先以1moL·L－1HCl溶解后，再用1moL·L－1NaOH调pH值至中性，加蒸馏水至所需浓度。实验时临时配制成溶液。

注射用环磷酰胺(Cyclophosphamide For Injection)，江苏恒瑞医药股份有限公司，批准文号:国药准字H32020857。

1.5 仪器及试剂

①低温冰箱(MDF－U50V型)，日本三洋;②电子天平AL204，METTLEY TOLEDO英国;③超净工作台，苏州净化设备厂;④电泳凝胶图象分析系统，Backman公司;⑤PVDF膜:美国Pall公司;⑥NC膜:美国PALL公司;⑦滤纸:Whatman 3mm;⑧丽春红:武汉博士德;⑨封闭用脱脂乳:sigma公司;⑩抗体:santa公司 baction(sc－47778)k－ras(sc－30)HRP羊抗兔二抗:sigma公司;⑩超敏发光液:鑫丰生物材料公司。

2 实验方法

2.1 胰腺癌BXPC－3裸鼠模型的建立

取冻存的胰腺癌细胞株BXPC－3，立即投入37℃水中，1min内融化，然后离心去除冻存液，用约10倍的冷RPMI1640完全培养液洗1次，接种于培养瓶中，待细胞贴壁后更换培养液。肿瘤细胞株培养在RPMI1640完全培养液中，置于37℃、饱和湿度、5%CO2的培养箱中，隔日换液，细胞长成单层后，用0.25%胰酶EDTA消化、传代。待细胞进入对数生长期后，收集细胞并用RPMI1640完全培养基调整浓度为5×106个/mL的细胞悬液备用，接种于40只裸鼠右腋窝皮下，每只鼠接种0.2mL(约含瘤细胞数1×106个)。

2.2 实验分组

40只裸鼠造模24h后随机分为5组，每组8只，分别为PAMD高、中、低剂量组，模型组对照组，阳性对照组。另取8只裸鼠作为空白对照组(不接种瘤株，给予同体积的生理盐水)。

2.3 给药剂量及给药途径

实验组每日给药剂量为PAMD高剂量20mg·kg－1，PAMD 中剂量 10mg·kg－1，PAMD 低剂量 5mg·kg－1，模型组及空白对照组每日给予同等容积生理盐水，环磷酰胺对照组给予注射用环磷酰胺156mg·kg－1(每周给药1次)。实验各组均采用腹腔注射给药，连续用药21d。

2.4 组织中总蛋白的提取

实验各组连续给药21d(药剂量及给药途径同实验一)后，次日摘眼球取血处死小鼠，并用酒精消毒操作部位皮肤，置于超净工作台中(事先以紫外线灯消毒30min)，以无菌操作剥取肿瘤结节，剔除纤维包膜和坏死组织，标记好放入事先准备好的液氮罐内保存。

将少量瘤组织块置于1～2mL匀浆器中，用干净的剪刀将组织块尽量剪碎。加入400μL单去污剂裂解液于匀浆器中进行匀浆。然后置于冰上，重复碾几次使组织尽量碾碎。裂解30min后，即可用移液器将裂解液移至1.5mL EP管中，然后在4℃下12000rpm离心5min，取上清分装于0.5mL EP管中，采用蛋白印迹技术(Western－blot)检测肿瘤k－ras蛋白表达的差异。放入显影液中，约15s后，放入清水清洗，放入定影液中定影。

2.5 分析方法

胶片采用Alpha image 2000凝胶成像系统扫描，所得图形使用Image－pro plus分析。计算各个指标样本的平均积分光密度(IOD)。

纵坐标为IOD，意思是平均积分光密度(IOD)，又称积分吸光度(IA)，为所测结构范围内各像素光密度值之和，即:IOD= ∑ODpixeli= ∑［log(Io/Ib)］...pixeli，为第i个像素的光密度值。积分光密度可反映所测结构的光密度与面积的综合变化。

2.6 统计学处理

3 实验结果

3.1 PAMD对胰腺癌K－ras、DPC4蛋白表达的结果见图1，图2。

图1 实验各组β－action蛋白表达

图2 实验各组K－ras蛋白表达

3.2 PAMD对胰腺癌K－ras蛋白表达的影响

实验结果表明，PAMD高、中、低剂量组及阳性对照组同模型组比较，K－ras蛋白相对表达量明显降低，差异具有统计学意义(P<0.01)。实验结果见表1。

表1 PAMD对胰腺癌K－ras蛋白表达的影响(±s)

表1 PAMD对胰腺癌K－ras蛋白表达的影响(±s)

注:各给药组分别与模型对照组比较，**P<0.01。

组别 n 给药剂量(mg·kg－1) K－ras相对表达量(K－ras/IOD) β－actin模型组 4 等体积8.8371±0.0828 100%PAMD高剂量组 4 20.00 3.2097±0.0403** 36.32±0.0062%**PAMD中剂量组 4 10.00 4.4126±0.0663** 49.93±0.0085%**PAMD低剂量组 4 5.00 5.1310±0.0478** 58.07±0.0084%**环磷酰胺对照组 4 156.00 4.1727±0.0216** 47.23±0.0067%**

4 讨论

胰腺癌是K－ras基因突变发生率最高的肿瘤，达75% ～100%［3～5］。ras基因编码一种结构高度相似的分子量为21kD的蛋白质，称为p21蛋白，K－ras基因编码表达的产物是ras蛋白，其结构与其他ras基因编码表达的ras蛋白具有高度同源性，功能也基本相同。ras蛋白始终处于GDP结合失活和GTP结合激活两种状态的循环中。当细胞外因素作用于细胞时，如EGF和EGFR结合，EGFR内源性酪氨酸激酶被激活，自身某些特异的酪氨酸磷酸化，并与Grb2等蛋白的序列相似域2(SH2)结合，促进Grb2等蛋白的SH3与SOS蛋白结合，使ras蛋白与GDP解离而与GTP结合，使ras蛋白活化，进而通过一系列细胞信号传导途径最终促进有关基因的表达。同时，ras蛋白自身的三磷酸鸟苷酶(GTPase)使GTP水解为GDP，使ras蛋白又回到失活状态。突变K－ras基因编码的ras蛋白可发生结构和(或)构像变化，其内源性GTPase活性几乎完全丧失，使ras蛋白一直处于活化状态，持续作用于下游各信号传导途径，使细胞发生转化，增生失控，最后恶变。

目前，越来越多的学者认为肿瘤可能是一种多基因疾病，基因治疗可能是治疗恶性肿瘤的有效途径。

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