蜈蚣败毒饮对小鼠尾部鳞片表皮颗粒层形成及血清IL－2影响的实验研究

杨素清，闫景东，周妍妍

(1.黑龙江中医药大学附属第一医院，黑龙江 哈尔滨 150040;2.黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040)

银屑病，中医学将其归属于“干癣”、“白疕”、“松皮癣”等病证范畴，是一种常见的慢性复发性、炎症性皮肤病，本病发病率高，病程长，易反复发作，严重影响了患者的身心健康，是国内外皮肤科领域重点研究和防治的疾病之一。迄今为止，银屑病的确切病因和发病机制尚未完全阐明。多认为是多基因遗传背景下T细胞介导的免疫异常性疾病，其发病主要涉及遗传、感染、免疫、神经、内分泌、环境等多方面的因素。目前，临床中治疗该病尚未有突破性进展。中医药治疗银屑病强调整体观念和辨证论治，用药灵活、治法丰富、疗效肯定，且副作用小、不易复发，显示出了明显的优势。

1 实验材料

1.1 动物

健康昆明种小鼠50只，雄性，体重(18～22)g，由黑龙江中医药大学实验动物中心提供。

1.2 药物与试剂

蜈蚣败毒饮(由黑龙江中医药大学附属第一医院中药局提供);复方青黛丸(陕西天宁制药有限责任公司，批号:060505);0.9%生理盐水(哈尔滨三精艾富西药业有限公司，批号:20023690)。

1.3 主要仪器

普通切片机(YD－1508，中国金华市医疗仪器厂);光学显微镜(OLYMPUS BX60，日本);病理图像分析系统(cimas Med 6.0，麦克奥迪图像技术有限公司)。

2 实验方法

2.1 蜈蚣败毒饮制备

蜈蚣败毒饮由蜈蚣3条，乌蛇30g，紫草30g，鬼箭羽30g，土茯苓30g，甘草10g组成，加8倍量水浸泡4h，加热煎煮1h，药渣再加6倍水，煎煮1h，过滤，两次滤液合并，最后浓缩成生药浓度分别为0.59g·mL－1(低浓度)、1.17g·mL－1(中浓度)、2.34g·mL－1(高浓度)。

2.2 复方青黛丸悬浊液的制备

当没有勇气接纳不幸，没有力量拥抱内心深处的痛苦或恐惧，在封闭地承受支离的心灵面前，除了尊重与等待，可选择的援助之一，是让当事人有机缘亲临一种彼此分享“教导自己认识自我”体验的场中，意识到要重获力量，必须复归自身认同与完整。而自身认同与完整的真谛，是尊重直面生命经历的一切，有定力让所有力量汇聚不分离。抽身静观自己的思想、情绪和身体，悦纳悲喜宠辱，不以物喜，不以己悲，是重新汇聚力量获得勇气更新的密钥。

复方青黛丸溶于生理盐水中，配成药物浓度为0.052g·mL－1的混悬液备用。

2.3 分组方法

将50只昆明种小鼠随机分成五组，即蜈蚣败毒饮低剂量组(简称中低组)、蜈蚣败毒饮中剂量组(简称中中组)、蜈蚣败毒饮高剂量组(简称中高组)、复方青黛丸组(简称阳性对照组)和生理盐水组。

2.4 给药方法

中低组、中中组、中高组、阳性对照组和生理盐水组，分别给予低浓度蜈蚣败毒饮［8.78g·(kg·d)－1］、中浓度蜈蚣败毒饮［17.55g·(kg·d)－1］、高浓度蜈蚣败毒饮［35.10g·(kg·d)－1］、复方青黛丸悬浊液［0.78g·(kg·d)－1］和生理盐水［15mL·(kg·d)－1］灌胃 15d。

2.5 取材

连续给药15d后，脱颈椎处死小鼠，摘眼球取血处死小鼠，并取距鼠尾根部约1.5cm处的背面皮肤，立即投入4%多聚甲醛溶液中固定，常规脱水，石蜡包埋，切片。

2.6 HE染色和IL测定

HE染色流程如下:二甲苯脱蜡→梯度酒精脱二甲苯→水洗→苏木素染色→盐酸乙醇分化→氨水返蓝→伊红染色→梯度酒精脱水→二甲苯透明→光学树胶封片→烘片。

IL－2的测定严格按照试剂盒说明书操作。根据预实验确定样本稀释倍数及标准曲线所使用的浓度，每个样本做双复孔。除空白孔外，分别将标本或不同浓度的标准品(100mL/孔)加入相应孔中，用封板胶纸封住反应孔，37℃孵箱孵育90min，洗板5次。除空白孔外，加入生物素化抗体工作液(100mL/孔)，37℃孵箱孵育 60min，洗板 5次。加入酶结合物工作液(100mL/孔)，37℃孵箱孵育 30min，洗板 5次。加入显色剂(100mL/孔)，避光37℃孵育10～15min，加入终止液，混匀后即刻测量OD450值。

2.7 统计学处理

3 实验结果

3.1 HE染色结果

在光学显微镜下观察，凡鳞片表皮有连续成行的颗粒细胞者，称为有颗粒层形成之鳞片，计数100个鳞片中有颗粒层形成的鳞片数。结果见图1～5及表1。

表1 蜈蚣败毒饮对小鼠尾部鳞片表皮颗粒层形成的影响(±s)

表1 蜈蚣败毒饮对小鼠尾部鳞片表皮颗粒层形成的影响(±s)

注:与生理盐水组比较，**P＜0.01;与阳性对照组比较，△P＜0.05;与阳性对照组比较，△△P＜0.01。

组别 n 颗粒层鳞片数/100鳞片生理盐水组10 9.10±2.13阳性对照组 10 19.6±3.41**中低组 10 19.4±3.20**中中组 10 22.8±4.29**△中高组 10 27.4±3.17**△△

如图所示，生理盐水组颗粒层细胞少，有缺失。阳性对照组与中药各剂量组颗粒层细胞较多，比较完整。中中组、中高组表现更为明显，能够显著促进小鼠尾部鳞片中颗粒层的形成，出现数层颗粒细胞，细胞肥大，呈菱形，胞浆内颗粒粗大、深染，细胞界限清楚，细胞核及核仁明显，细胞体积增大。

图1 生理盐水组40×

图2 阳性对照组40×

图3 中低组40×

图4 中中组40×

图5 中高组40×

3.2 对小鼠血清IL－2的影响 结果见表2。

表2 蜈蚣败毒饮对小鼠血清IL－2的影响(±s)

表2 蜈蚣败毒饮对小鼠血清IL－2的影响(±s)

注:与生理盐水组相比，**P<0.01;与阳性对照组相比，△P<0.05。

组别 n 血清IL－2(pg·mL－1)10 4.20±0.68阳性对照组 10 2.94±0.44**中低组 10 2.95±0.61**中中组 10 2.62±0.40**中高组 10 2.45±0.47生理盐水组**△

4 讨论

银屑病发病急，反复发作，不易根治，与中医“毒、邪”致病特点相符。所谓“毒邪”，不仅是指从外感受的特殊致病因素，如有毒食物、药物、化学制剂等所致的毒性反应，也是人体受某种致病因素作用后在疾病过程中所形成的病理产物，如热毒、湿毒、风毒、火毒等。毒邪致病特点是发病急骤，发展迅速，易于传变，病情重，病程久，顽固难愈。毒邪侵入人体，致气血凝滞，经脉不畅，毒邪久积不化又生瘀毒，瘀滞肌肤。现代医学研究亦表明，银屑病患者常有全血粘度增高，真皮乳头毛细血管扩张，临床可见薄膜现象和点状出血，这些均符合中医“血瘀”理论。笔者总结多年临床经验，认为“毒”、“瘀”二邪是银屑病发病的主要病理基础。基于这一理论，创制了解毒清热、活血化瘀的蜈蚣败毒饮并将其用于临床银屑病患者的治疗，取得了很好的疗效。方中蜈蚣为君药，以毒攻毒，取其解毒、化瘀、祛风之功，一药而三用，且其善行之性入络剔毒，直捣病所。紫草尤善清血分热毒，本方取其凉血、活血、解毒之功;鬼箭羽破血、通经、杀虫，其寒能坚阴清热，又能入血，是常用的活血化瘀药，具有破血、通经、解毒之功;土茯苓解毒除湿，通利关节。上三药祛热毒、瘀毒、湿毒，共为臣药。乌梢蛇搜风邪，通经络，蛇类善行，祛风而能止痒，其性走窜，能搜风邪，透关节，通经络;配蜈蚣，剔除经络之风，为佐药。生甘草既调和诸药，又保护胃气，且兼解毒，为使药。纵观全方，共奏解毒祛瘀、搜风通络之功。本方特点为重用虫类药物，利用其毒性之偏，以毒攻毒，并取其善行之性入络剔毒，直捣病所。

迄今为止，银屑病的发病机制尚不清楚，但是诸多因素导致的角质形成细胞过度增殖或分化障碍是其发病的基础。银屑病表皮的主要病理生理特点包括增生过快和角化不全两个方面，基底细胞增殖加快，表皮通过时间由正常的28～56d缩短为3～4d，使角质形成细胞来不及成熟，故出现角化不全、颗粒层减少或消失的银屑病典型病理特点［1］。小鼠尾部鳞状上皮颗粒层细胞天然缺失，仅在毛囊处有少量的颗粒细胞，故可模拟银屑病角化不全的病理特点。因此，鼠尾表皮模型属天然模型，是目前公认的实验性银屑病病理模型之一［2］。此模型简便易行，重复性好，在银屑病药物研究中较为常用。实验结果表明，蜈蚣败毒饮可显著促进小鼠尾部鳞片中颗粒层细胞的形成，并随剂量的增大而作用增强。且中、高浓度组的蜈蚣败毒饮疗效优于复方青黛丸组。由此推断，蜈蚣败毒饮是治疗银屑病的有效复方中药制剂，其作用机制可能与改善银屑病表皮细胞角化不全有关。

IL－2可促进B细胞分化，增加其分泌抗体的能力及促进NK细胞活性，是免疫调节中最关键的细胞因子，作为T细胞活化所必需的第3种信号，IL－2与IL－2受体(IL－2R)的结合对于T细胞的活化与增殖起着至关重要的作用;另外IL－2还可诱导c－myc及IL－2R表达，诱导细胞分泌IFN－γ、TNF、CSF等细胞因子，引起细胞因子网络的失衡。银屑病患者皮损处的IL－2异常增高是银屑病发病组织损伤的病理基础，是导致疾病发生的重要环节。目前已有学者提出，可通过阻止IL－2的产生或抑制其活性来特异性防止T细胞激活从而达到治疗银屑病的目的［3］。本研究采用ELISA方法测定各组小鼠血清IL－2水平，结果表明，各剂量蜈蚣败毒饮均可降低小鼠血清IL－2的水平，与生理盐水组比较，有显著性差异(P<0.01);且中高组的效果优于阳性对照组，有显著性差异(P<0.05)。提示蜈蚣败毒饮抗银屑病的作用可能与降低血清IL－2水平有关，通过降低血清IL－2水平，从而改善免疫功能状态而发挥治疗作用。

［1］ 陈洪铎.皮肤性病学［M］.第4版.北京:人民卫生出版社，1999:110－115.

［2］ 林熙然，黄敏.喜树酊治疗银屑病的临床观察及实验研究［J］.中华皮肤科杂志，1982，15(4):210.

［3］ Salim A，Emerson R.Targeting interleukin－2 as a treatment for psoriasis［J］.Curr Opin Investig Drugs，2001，2(11):1546 －1548.