脓毒症大鼠肌肉恶病质发生机制的实验研究

刘敏丰,高志光,秦环龙

(1.江苏省无锡市第三人民医院消化科,江苏无锡,214041;2.上海交通大学附属第六人民医院,上海,200233)

在脓毒症、严重创伤、烧伤和外科大手术后,机体以明显的代谢紊乱为特征,表现为糖和脂的利用障碍,而蛋白则处于高分解代谢状态,骨骼肌蛋白大量消耗,肌肉萎缩,疲乏无力,这种现象称之为肌肉恶病质。当前对于感染后肌肉降解的分子机制并不明确,本文探讨脓毒症时肌肉恶病质发生的分子机制,为临床治疗提供理论基础。

1 材料和方法

1.1 实验动物和分组

雄性SD大鼠20只(复旦大学医学院动物中心提供,清洁级),体重250～320 g。随机分为2组:正常组和脓毒症组,每组10只。采用盲肠结扎穿孔法1(CLP)建立脓毒症动物模型。正常鼠食喂养5天,在氯胺酮腹腔注射麻醉(40 mg/kg)下,分别采集门静脉血和趾长伸肌组织行相应指标检测。

1.2 主要实验试剂和仪器

①氨基酸标准品,Sigma公司;②兔抗大鼠泛素多抗体,美国Dako公司;③Envision试剂,美国Dako公司;④大鼠TNF-α、IL-1、IL-6、皮质醇试剂盒(ELISA法),美国DSL公司;⑤Agi-Lent高效液相色谱仪;⑥医学图像分析软件,上海申腾信息技术有限公司;⑦iCycLer定量PCR仪,美国 Bio-Rad公司;⑧DNA thermaL CycLer 480 PCR 仪,美国Perkin EmLer公司 。

1.3 实验方法

血清细胞因子和皮质醇浓度测定:①于术后第6天,大鼠在腹腔麻醉下,打开腹腔,取门静脉血1 mL,离心(2 000 rpm,5 min),取血清,备用;②采用双抗夹心ELISA法,根据相应试剂盒操作步骤,分别对标准品和血清样品进行反应;③根据标准品检测结果绘制标准曲线;④根据标准曲线查出待测样品浓度。

高效液相色谱-荧光检测法检测趾长伸肌组织内三甲基组氨酸(3-MH)浓度:①无菌、快速分离大鼠趾长伸肌称重后,高速匀浆并离心,吸取上清液,待用;②配制氨基酸标准液,终浓度250 pmoL/μ L;③柱前衍生;④色谱条件:流动相采用10 mmoL/L磷酸钠缓冲液(含30%乙腈,pH 7.50),等度洗脱,流速1.0 mL/min;进样量100 μ L;柱温:室温;荧光检测波长:激发365 nm,发射460 nm;⑤利用3-MH标准品制备标准曲线;⑥根据标准曲线定量。

电镜观察骨骼肌纤维超微结构:活体快速采取大鼠趾长伸肌组织,用刀片修整成1 mm 3小块后,2.5%戊二醛固定,放置4℃冰箱保存。统一脱水后用环氧树脂618包埋,超薄制片,定位,醋酸双氧铀和枸橼酸铅染色,利用透射电镜观察骨骼肌纤维大体形态和胞质内细胞器改变。

免疫组化检测骨骼肌泛素蛋白:①取大鼠趾长伸肌组织,常规福尔马林固定,脱水,透明,石蜡包埋和切片,采用Envision两步免疫组化法检测泛素蛋白水平表达。②结果观察:OLYMPUS BH2显微镜,阳性产物为棕黄色或棕褐色,并呈颗粒状,背景为蓝色;③数码拍照后计算机图像处理:数码照片使用 PANASONIC MV-CP410相机拍摄;采用IMS细胞图像分析系统,医学图像分析软件,在相同放大倍数(200)下,于各组切片中随机选取9个视野,计算平均阳性指数,阳性指数=每视野显色阳性面积×每视野光密度值(OD)。

实时荧光定量PCR(reaL-time qPCR)检测大鼠骨骼肌泛素mRNA:①引物和探针见表1;②取大鼠趾长伸肌组织,放入研钵中加液氮研磨成粉末;③利用 TrizoL试剂盒一步法提取总RNA;④逆转录;⑤相同条件下分别对标准品PGEMT质粒和待测样品进行实时荧光qPCR;⑥根据标准品的已知浓度和结果绘制标准曲线;⑦根据标准曲线,分别算出样本的检测指标和标准品的浓度,然后计算各样本的检测指标与对应的标准品的浓度的比值作为结果。

表1 引物和Taqman探针

2 结 果

体重变化:实验前后,脓毒症组大鼠体重明显下降(43.5±5.80 g)。

血清细胞因子和皮质醇浓度:与正常组相比,脓毒症组大鼠血清细胞因子和皮质醇浓度均明显升高(P<0.01),见表2。

表2 血清细胞因子和皮质醇浓度

趾长伸肌组织3-MH浓度:脓毒症组大鼠3-MH浓度(8.85±0.30 nmoL/g)明显高于正常组(4.53±0.18 nmoL/g),差异有明显统计学意义(P<0.01)。

电镜骨骼肌纤维形态学检测:透视电镜下观察可见正常对照组大鼠趾长伸肌肌小节完整,肌丝排列整齐,线粒体呈杆状,嵴完整。脓毒症组大鼠趾长伸肌镜下可见肌原纤维排列松散,线粒体肿胀、破裂,部分肌小节肌丝溶解。

骨骼肌泛素蛋白表达:免疫组化图像和图像分析结果显示,与正常组相比,脓毒症组大鼠趾长伸肌组织泛素蛋白表达明显增强(P<0.01),见表3。

表3 图像分析结果

骨骼肌泛素mRNA表达:脓毒症组大鼠趾长伸肌组织泛素mRNA表达(0.426±0.042)明显高于正常组(0.112±0.014),差异有显著统计学意义(P<0.01)。

3 讨 论

在脓毒症、严重创伤、烧伤和外科大手术后,机体以明显的代谢紊乱为特征,表现为糖和脂的利用障碍,而蛋白则处于高分解代谢状态,骨骼肌蛋白大量消耗,肌肉萎缩,疲乏无力,这种现象称之为肌肉恶病质。由于肌肉是机体最大的蛋白质储存库,肌肉蛋白的消耗将占据机体蛋白丢失的重要部分,持续而严重的肌肉消耗会导致明显的肌原纤维水解增加,引起肌肉萎缩和耗竭,不利于患者的疾病恢复,如累及呼吸肌,持续的人工呼吸支持又会增加相关的呼吸道并发症[1-2],从而增加外科危重患者的死亡率。

不同原因致临床肌肉恶病质发生的细胞内机制和分子调节机制基本类似。其中蛋白合成减少和氨基酸摄入减少虽然也是造成骨骼肌代谢反应异常的原因,但蛋白降解增加,尤其是肌原纤维蛋白质中的肌动蛋白和肌球蛋白的降解增加是导致肌肉恶病质的最重要原因。而泛素-蛋白酶体途径在多种蛋白质的降解过程中发挥着重要作用,而且具有高度的特异性。越来越多的研究发现,由各种原因如脓毒症、烧伤、肾衰竭以及肿瘤等所引起的骨骼肌代谢障碍中,泛素-蛋白酶体途径介导的蛋白质降解起着不容忽视的主导作用。

泛素是含有76个氨基酸残基的多肽,分子量约8.5 ku,属高度保守蛋白。1975年首先从小牛的胰腺中分离出来,因广泛存在于各种真核细胞和组织中而得名。

脓毒症时骨骼肌蛋白的降解增加是由泛素-蛋白酶体途径被激活而造成的。1994年,Tiao等[3]通过研究大鼠盲肠结扎穿孔模型研究了不同细胞内蛋白水解通路在脓毒症时骨骼肌蛋白降解中的作用,发现溶酶体途径和钙/钙激活蛋白酶途径介导的蛋白水解在正常组和脓毒症组差异不大,而泛素-蛋白酶体途径介导的蛋白水解在脓毒症组的总体蛋白降解和肌纤维蛋白降解分别增加172%和440%,脓毒症组大鼠泛素mRNA也相应增加了数倍,结果显示脓毒症骨骼肌蛋白降解中起主导地位的是泛素-蛋白酶体途径。而国内柴家科等[4]也研究发现,脓毒症大鼠骨骼肌组织中的泛素和泛素化蛋白的表达明显上调,而且与肌纤维蛋白降解率在时相上呈协同增强作用。

一些细胞因子和糖皮质激素是脓毒症肌肉恶病质时最重要的调节因子,有研究发现脓毒症大鼠血浆中糖皮质激素水平显著增高[5];实验大鼠给予地塞米松后伸趾长肌蛋白分解率显著升高,且呈量-效关系[6];另有报道由脓毒症或外伤诱导产生的肌肉降解可以通过给予糖皮质激素受体阻滞剂RU38486得以减轻[7]。一般认为糖皮质激素是通过激活泛素-蛋白酶体途径而促进肌蛋白降解的。细胞因子对肌肉恶病质的调节机制目前尚不明了,但多数学者还是肯定了其与肌肉恶病质的关系。与肌蛋白降解有关的细胞因子主要有TNF、IL-1和IL-6。有研究认为,这些细胞因子能直接增强骨骼肌局部组织中溶酶体内不同组织蛋白酶的活性而导致其蛋白质分解代谢增强。也有研究表明这些细胞因子通过激活肌组织中的泛素-蛋白酶体活性来增强其降解而起间接作用。应用细胞因子的拮抗剂如己酮可可碱和苏拉明可以明显降低泛素-蛋白酶体途径和钙/钙激活蛋白酶途径的活性,减少肌蛋白的降解[8]。

本实验对脓毒症骨骼肌降解发生机制进行了初步研究,通过免疫组化和reaL-time qPCR分别检测大鼠趾长伸肌组织泛素蛋白和泛素mRNA表达,利用电镜技术观察骨骼肌纤维超微结构变化,采用高效液相色谱-荧光法检测趾长伸肌组织内3-MH浓度,3-MH是一种只存在于肌肉肌动蛋白和肌凝蛋白的氨基酸,由于分解代谢时释放产生的3-MH不再参与骨骼肌细胞新蛋白的合成,故其释放量可间接反映肌纤维蛋白的降解情况。结果显示脓毒症组大鼠骨骼肌组织内泛素蛋白和泛素mRNA表达明显上调,而且增加明显,电镜下表现为分解代谢旺盛,而3-MH浓度也随之明显增加,提示肌纤维蛋白降解增强,同时证实骨骼肌蛋白的降解与泛素-蛋白酶体途径关系密切,泛素-蛋白酶体途径在脓毒症大鼠骨骼肌降解过程中可能起着关键性作用。

本实验也发现脓毒症组大鼠血清内皮质醇、TNF-α、IL-1和IL-6浓度较正常组明显升高,提示皮质醇、TNF-α、IL-1和 IL-6可能在脓毒症肌肉恶病质的发生发展过程中起着直接或间接的调节作用,具体机制有待进一步探讨。

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