山东潍坊地区汉族人群对氧磷酶Q192R基因多态性与冠心病的相关性的研究

翟振道 邢旭东 秦浩 季祥武

对氧磷酶(paraoxonase，PON)是由肝脏合成的一类与高密度脂蛋白(HDL)结合的芳香酯酶。PON合成后即与肝脏合成的apoA结合，参与HDL的形成并释放入血。PON还能部分水解脂质过氧化物，保护低密度脂蛋白(LDL)免受氧化修饰，减少氧化型脂质积聚［1］。国内外对Pon1Q192R基因多态性与冠心病的相关性研究结果不一，本研究通过对基因型分布及危险因素(血糖、血脂、血压)在不同基因型QQ、QR、RR之间的影响性进行分析，给冠心病发病机制提供部分参考依据。

1 资料与方法

1.1 调查对象 随机选择2004年4月至2005年12月在潍坊市人民医院心内科冠心病患者128例，男80例，女48例，年龄36～82岁，平均(65.25±9.83)岁，其中心肌梗塞69例，72例经冠脉造影确诊。病例符合2004年世界卫生组织(WHO)关于缺血性心脏病的命名和诊断标准，冠心病组病例均有心梗病史或经冠状动脉(冠脉)造影确诊，冠脉造影时，各主要分支存在＞70%狭窄定义为有意义病变。随机选择同时期健康查体者110例，男66例，女44例，年龄31～87岁，平均(63.52±7.91)岁，作为对照组。对照组和冠心病组年龄、性别构成差异无显著性(P＞0.05)，经详细的询问病史和体格检查，心电图、血常规、血生化检查，简化OGTT试验，排除冠心病、糖尿病、高血压患者。所有调查个体间无血缘关系。

1.2 实验方法

1.2.1 血液基因组DNA的分离及PCR扩增 按Erlich微量DNA全血提取法提取基因组DNA;抽取空腹12～14 h静脉血0.5 ml(EDTA抗凝)，加0.5 ml裂解液，离心2 min(15000r/min)，弃上清。加裂解液0.75 ml，重复上述操作2次。加入A 缓冲液 0.5 ml，3 μl蛋白酶 K(1mg/ml)，55℃ 水浴 2 h，100℃煮10 min后，于-20℃保存备用。PCR引物序列为上游5＇-TATTGTTGCTGTGGGACC-TGAG-3＇，下 游 5＇-CACGCTAAACCCAAATAC-ATCTC-3＇。PCR 反应系统总体积为 30 μl，含 0.5μmol/L 引物，1.5 mmol/L MgCl2，200 μmol/L dNTP，0.2 ug DNA模板，2.0 UTaqDNA聚合酶，加矿物油复盖后，95℃变性 5 min 后，94℃ 1 min，61℃ 1 min，72℃ 1 min，进行35个循环后，72℃保温7 min结束反应。以2%琼脂糖凝胶电泳检查PCR扩增产物。

1.2.2 PCR扩增产物的消化及电泳 取10 μl PCR扩增产物，加5U限制性内切酶Alw(NewEngland Biolabs)，37℃消化3 h，取消化产物加入3%低熔点琼脂糖凝胶板，在TBE缓冲液中电泳40 min。溴乙锭染色20 min，紫外光下拍照。

1.2.3 血脂血糖的检测 晨起空腹12 h取静脉2 ml血，应用CX-9生化分析仪检测血脂、血糖，血脂检测包括TC、TG、HDL、LDL，单位mmol/l。正常对照组加做简化OGTT试验。以上试剂盒均由北京利德曼生化技术有限公司提供。

1.3 统计学处理 对所有数据采用SAS 8.0软件进行统计学处理，其中计量资料采用t检验(或t’检验)，计数资料采用χ2检验。

2 结果

2.1 冠心病组与对照组的临床资料情况见表1。

表1 冠心病组与对照组的临床资料比较(x±s)

由表1可见:两组男女比例，年龄无显著性差异(P＞0.05)，舒张压、BMI、胆固醇、LDL两组差异无统计学意义(P＞0.05)。冠心病组的收缩压、三酰甘油、BS均明显大于对照组，而HDL低于对照组，差异有统计学意义(P＜0.05)。

2.2 病例组与对照组基因型分布及等位基因频率比较见表2。

表2 病例组与对照组基因型分布及等位基因频率

等位基因频率［2］=(2×纯合子数+杂合子数)/2÷受检人数

经计算，正常对照组与冠心病组的基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡。冠心病组与对照组比较χ2=1.6686，自由度=2，P=0.4342，基因型分布差异无统计学意义，等位基因频率也差异无统计学意义(P=0.3717)。

2.3 PON1基因型与冠心病经典危险因素的分布见表3。

表3 PON1基因型与冠心病经典危险因素的分布

由上表可见:冠心病患者不同的PON1基因型与传统的冠心病危险因素比较，除吸烟外差异均无显著性(均P＞0.05)吸烟对含R基因的人群患冠心病具有更高的易感性。

2.4 限制性内切酶Alw 消化PCR扩增产物电泳结果PCR产物经限制性内切酶Alw消化后，当该位点二等位基因均为纯合子Q/Q时，PCR产物不被酶切，显示99bp一条带;当该位点二等位基因均为纯合子R/R时，PCR产物均被酶切，产生31bp和68bp两条带;当该位点二等位基因为杂合子Q/R时，则显示31bp、68bp和99bp三条带。结果见图1。

图1 PON1基因Q/R多态性分析电泳结果

由图1可见:PON1基因有99bp(Q)和68 bp+31bp(R)两个基因片断，三种基因型:QQ、QR和RR型。

3 讨论

PON1是由355个氨基酸组成，相对分子质量为43～45×104的编码蛋白［3］，含有3个半胱氨酸残基，只有284位的残基含有自由巯基组，是人类惟一与HDL结合的酶和血浆中惟一被发现的同工酶，因此，对它的研究比较广泛。与其它的分泌蛋白比较，PON1的独特特征是保留了N末端的疏水信号引导序列，能水解有机磷底物和对氧磷，个体间PON1抗对氧磷的酶活性相差10～40倍。

Sanghera等［4］研究认为，结合在HDL-C上的PON蛋白能将脂质过氧化物水解成乙醇和羧酸，PON与HDL-C上的另一种酶即血小板活性因子-乙酰水解酶(PAF-AH)协同作用，可使HDL发挥抑制LDL-C氧化修饰作用。LDL-C的氧化在动脉粥样硬化的发病中起重要作用，纯化的人血清PON能减少LDL-C的氧化，降低体内OX-LDL水平，降低脂质过氧化物在血管壁的积累，从而起到了预防动脉壁粥样硬化的发生或减缓其进程的作用，这可能是PON预防动脉硬化形成的机制。

自从PCR技术应用来，PON1192Q/R研究成果较多。对280例西班牙心肌梗死(MI)患者研究显示MI患者的血清PON1活性较对照组明显下降(216 U/L对比226 U/L)，PON1活性随着年龄增加而下降［5］。有些研究未发现PON1基因多态性与冠心病有关。而是与PON1活性有关［6］。国外研究也有研究显示PON1基因的Q192R多态性与CHD严重性、冠状动脉粥样硬化进展程度、血脂水平和降血脂药物治疗效果相关［7］。目前更多的研究PON1活性是冠心病的预测因素［8］。PON1活性及生物作用-抗氧化作用的水平决定了冠心病的程度［9］。

冠心病是多因素引起的疾病，在分析时只针对一个因素而在其他因素不均等的条件下分析，得出的结果是不可靠的。本研究设计是在正常对照组中测出各基因型，同时在随机的冠心病(心肌梗塞或冠脉造影明显狭窄＞70%)的病例组中测得各基因型和基因频数的比例，通过统计学处理，两者差异无统计学意义。

本研究显示，任何一种基因型都是在外界致病危险因素的作用下起作用的，任何一种基因型在没有肥胖、血压、血糖、血脂异常情况下就不会导致动脉粥样硬化，在作用机制未明确的情况下，某些基因型最多只能说明是易患因素。PON1的作用是确定的，但它的生化作用机制不清，需进一步明确。本研究结果与以往报道有所不同，可能是与以往认为有关的结果是由于选择研究对象的偏差和小样本作用的结果［10］。这也显示着，象糖尿病，家族性高脂血症等在基因多态性并发CHD的高危方面起到了很大的作用。

［1］Kitchen B J，Master C J，Winzor D J.Effects of lipid removal on the molecular size and kinetic properties of bovine plasma arylestesterase.Bioc he m，1973，135:93-99.

［2］杜传书.医学遗传学基础.人民卫生出版社，1995.

［3］Mackness M I，Mackkness B，Durrington P N.Paraoxonase and coronary heart disease.Atheroscler Suppl，2002，3(4):4955.

［4］Mackness M I，Mackness B，Durington P N，et al.Paraoxonase and coronary heart disease.CurrOpinLipidol，1998，9(4):319.

［5］Ilia Leview，Alberto Righetti，Richard W，James，et al.Paraoxonase promoter polymorphisms T(-107)C and relative paraoxonase deficiency as determinants of risk of coronary heart disease.Mol Med，2001，79:457-463.

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［7］Shih D M，Gul，Xia Y R，et al.Micelacking serum paraoxonase are susceptible to orangnohosphatet oxicity and atherosclerosis.Nature，1998，394:284-287.

［8］Twakura A，Shastry S，Luedemann C，et al.TagSNP analyses of the Pon gene cluster.Effects on Pon1 activity.LDL.Oxidative J lipid.Res，2006 May，47(5):1014-1024.

［9］Siner R，Dotyc I.The correlation of paraoxonose(Pon1)activity with lipid and lipoprotein levels differs with vascular disease status.J lipid.Res，2005，46(9):1888-1895.

［10］Colhoun H M，McKeigue P M，Davey Smith G.Problems.of reporting genetic associations with complex outcomes:can we avoid being swamped by spurious findings.Lancet，2003，361:865-872.