框镜鲤致病性维氏气单胞菌的分离鉴定

龚 倩，高淑琴，单晓枫，郭伟生，孟庆峰，王伟利*，钱爱东*

(1.吉林农业大学动物科学技术学院，吉林长春130118；2.吉林省东辽县卫生学校，吉林东辽136600；3.吉林出入境检验检疫局，吉林长春130062)

框镜鲤(Cyprinus carpio)是以德国镜鲤为亲本，人工选育的优良鱼种，为吉林省淡水鱼养殖的一个重要品种。但其抗逆性差，对病原易感性强[1]。2008年6月～7月间，吉林省某养殖户养殖的框镜鲤出现大量死亡，病鱼主要表现为肛门红肿，体表局部出现红点，剖检可见主要脏器有出血点，消化道粘膜出血。由濒死鱼体内分离一株致病性病原菌，经生理生化试验，16S rRNA序列分析，鉴定该菌株为维氏气单胞菌(Aeromonas veronii)，现将研究结果报告如下。

1 材料和方法

1.1 病料样品来源 病鱼采自吉林省某框镜鲤养殖场濒死鱼；健康框镜鲤由吉林省某养殖场提供，体质量为100g左右。

1.2 主要试剂 RS琼脂、细菌微量生化反应管购自北京陆桥技术有限责任公司；Prem in-Taq和DNA Marker(DL2000)购自TaKaRa公司；药敏纸片购自杭州天和微生物试剂有限公司。

1.3 病原菌的分离 取发病症状典型的框镜鲤，采集肌肉、心血、肝脏、胰脏等组织样品，划线接种于营养琼脂平板和RS琼脂平板，28℃培养24h，挑取形态一致的优势菌群进行纯培养。

1.4 动物回归试验 将分离菌株接种于营养琼脂斜面28℃培养24h，用PBS稀释成1.98×108cfu/m L的菌悬液，以每尾0.2m L的剂量腹腔注射接种健康框镜鲤，对照组注射0.2m L PBS，每组各注射8尾，饲养水温保持22℃左右。持续观察7d，同时对病死鱼进行病原菌的分离，并观察和鉴定其形态及理化特性。

另外，采集自然发病症状典型的濒死鱼组织脏器，添加无菌PBS(比例1g∶5m L)进行研磨，反复冻融。10000r/min离心，上清用0.22μm滤膜过滤，滤液接种健康鱼，方法同上。

1.5 病原菌的鉴定

1.5.1菌体形态与菌落形态观察将纯培养的菌划线接种于RS琼脂平板和营养琼脂平板，28℃培养24h，观察菌落形态；挑取单个菌落做革兰氏染色，观察菌体形态。

1.5.2主要生化性状测定参照微量生化反应管说明书鉴定分离菌纯培养物。

1.5.316S rRNA基因序列分析挑取单个菌落于灭菌水中，99℃10min变性后4℃12000r/min离心5min，取上清作为模板，进行PCR扩增。引物为细菌16S rRNA通用引物：上游引物AGAGTTTG ATCCTGGCTCAG，下游引物ACGGTTACCTTGTT ACGACTTC。反应条件：94℃5min；94℃1min、55℃ 1m in、72℃ 1.5m in，30个循环；72℃5m in。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测并回收纯化。引物合成和测序由TaKaRa公司完成。

测序结果通过NCBI的BLAST检索系统进行序列相似性比较，并使用DNAStar软件进行分析，与GenBank中登录的细菌株序列进行比较，构建系统发育树。

1.6 药敏试验 将分离菌菌稀释成5×106cfu/m L浓度，取0.1m L该浓度菌液均匀涂布于营养琼脂平板上，干燥后贴上药敏纸片，30℃培养24h，观察抑菌圈并测量抑菌圈直径。

2 结果与讨论

2.1 病原菌的分离与动物回归试验 由自然感染的濒死鱼体内分离一株优势菌株，命名为CY0806，经动物回归试验，腹腔接种框镜鲤，在5d内全部死亡，对照组无异常表明该细菌株具有较强的致病性。剖检病死鱼，病理变化与自然病死鱼相同，并且从中也分离出与CY0806菌体形态和理化特性相同的细菌。而将组织滤液接种鲤鱼，并未出现发病死亡现象，因此该框镜鲤死亡的病因为细菌感染所致，而非病毒感染。

2.2 病原菌的鉴定 经28℃培养24h，细菌株CY0806在营养琼脂上生长的菌落呈圆形、表面光滑湿润、边缘整齐、白色、不透明；而在RS琼脂上菌落呈圆形、光滑湿润、扁平、黄色、菌落边缘略显粗糙、刮去菌落留下黄色菌落痕迹。镜检为革兰氏阴性杆菌。

依据CY0806菌体形态和理化特性检测结果(表1)，参照伯杰氏鉴定细菌学手册、鱼类和其他水生生物细菌实用鉴定手册，初步判定CY0806为A.veronii。

表1 分离菌的理化特性Table 1Physical and biochem ical properties of the isolated bacteria

以细菌株CY0806的DNA为模板，通过16S rRNA通用引物，扩增出长度约1500bp的片段(图1)，测序结果显示克隆片段长1458bp。将其基因序列用BLAST进行同源性比较，依据同源性检索结果，选取不同气单胞菌种属的代表株构建系统发育树，结果显示其与维氏气单胞菌16S rRNA基因序列相似性为100%(图2)，因而从分子水平上进一步证实细菌株CY0806为A.veronii。

A.veronii在人机体抵抗力下降时，可引发坏死性脑膜炎、败血症、腹泻等疾病[2-4]。此外，该菌还可引发鱼类病害：在国外有报道该菌曾引发孟加拉国鱼类流行性溃疡综合征[5]；在国内，研究者也陆续从中华绒螯蟹、青虾、泥鳅和西伯利亚鲟等体内分离出致病性A.veronii[6-9]。因此，A.veronii是一种人-兽-鱼共患病原菌。本研究在国内首次从框镜鲤体内分离一株致病性A.veronii。该菌株经动物回归试验，显示其对框镜鲤具有较强的致病性，但对其他水生生物和哺乳动物是否具有致病性，还需进一步试验研究。

本实验在病原菌的分离鉴定时，采取选择性培养基、理化特性、16S rRNA序列分析等相结合的方法，快速得到病原菌，在鉴定时几种方法相互验证，使鉴定结果更可靠，最终确定CY0806为A.veronii。

2.3 药敏试验 菌株CY0806经对20种药物的敏感性试验，结果表明：该细菌株对庆大霉素、诺氟沙星、环丙沙星、氧氟沙星、呋喃唑酮、头孢噻吩、氯霉素、红霉素、阿奇霉素、新霉素和氟哌酸等11种药物高度敏感，抑菌圈直径为20mm～40mm；对卡那霉素、复方新诺明、呋喃妥因、多粘菌素B、磷霉素和链霉素等6种药物中度敏感，抑菌圈直径为10mm～19mm；对四环素、新生霉素和青霉素G等3种药物耐药，抑菌圈直径为0mm～9mm。该结果与潘晓艺等[7]和马志宏等[9]所报道结果不尽相同，这可能与细菌株的来源和区域分布不同有关；此外，试验结果在药物防治框镜鲤A.veronii感染时合理选择用药，以及耐药规律的研究提供实验依据。

[1]宫会顶，王武民，张卓.池塘养殖镜鲤主要病害的治疗及综合防治措施[J].中国水产，2008(9)：67-68.

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[3]Cui H,Hao S,Arous E.A distinct cause of necrotizing fasciitis:Aeromonas veronii biovar sobria[J].Surg Infec,2007,8(5):523-528.

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[5]Rahman M,Colque-Navarro P,K hn I,et al.Identification and characterization of pathogenic Aeromonas veronii biovar sobria associated w ith epizootic ulcerative syndrome in fish in Bangladesh[J].Appl Environ M icrobiol,2002,68(2):650-655.

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[7]潘晓艺，沈锦玉，李建应，等.青虾“软壳综合症”病原及其特性[J].微生物学通报，2009，36(10)：1571-1576.

[8]秦蕾，徐静，张晓军.泥鳅的凡隆气单胞菌感染[J].中国人兽共患病学报，2008，24(12)：1100-1102.

[9]马志宏，杨慧，李铁梁，等.西伯利亚鲟致病性维氏气单胞菌的分离鉴定[J].微生物学报，2009，49(10)：1289-1294.