H9N2亚型禽流感病毒的遗传进化分析及F株灭活疫苗的免疫效果评价

童海兵，张小荣，吴艳涛，刘学贤，龚建森，刘秀梵*

(1.扬州大学兽医学院，江苏扬州225009；2.中国农业科学院家禽研究所，江苏扬州225009)

禽流感是由A型流感病毒引起的禽类急性呼吸道传染病。禽流感病毒(Avian influenza virus，AIV)属于正粘病毒科，是一种分8个节段的单股、负链RNA病毒。病毒粒子囊膜表面分布血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)两种糖蛋白，目前已经发现16种HA亚型和9种NA亚型[1]。H9N2亚型AIV对于禽类为低致病性，但在混合感染或继发感染其他病原的情况下，仍可引起高发病率和死亡率[2-3]。由于我国普遍使用H9亚型禽流感灭活疫苗，免疫压力下病毒变异加快，出现多个基因亚型的H9N2亚型AIV流行毒株[4-6]。本研究对2009年～2010年期间从免疫鸡群中分离的H9N2亚型AIV毒株进行HA基因序列测定和分析，以了解病毒的变异情况，并评价了用于制备H9亚型F株禽流感灭活疫苗对分离毒株的免疫效果。

1 材料和方法

1.1 H9N2亚型AIV毒株 9个分离毒株为：A/Chicken/Anhui/L9/2009(简称 L9株)、A/Chicken/Fujian/F9/2009(简称 F9株)、A/Chicken/Fujian/F119/2009(简称 F119株)、A/Chicken/Fujian/S9/2009(简称S9株)、A/Chicken/Henan/YD/2009(简称 YD 株)、A/Chicken/Jilin/D9/2009(简称 D9株)、A/Chicken/Zhejiang/M/2009(简称 M 株)、A/Chicken/Anhui/W 9/2009(简称 W 9株)、A/Chicken/Jilin/D119/2009(简称 D119株)，这些毒株是于2009年～2010年期间从接种过H9亚型F株禽流感灭活疫苗的鸡群中分离。疫苗毒株为A/chicken/Shanghai/F/98(F株)[6]，由扬州大学农业部畜禽传染病学重点开放实验室提供。

病毒半数鸡胚感染量(EID50)的测定方法为：将病毒用灭菌PBS作10倍稀释，取10-5～10-106个稀释度，尿囊腔接种5个10日龄SPF鸡胚(购自北京梅里亚维通公司)，37℃培养72h后，测定每个鸡胚尿囊液HA价，利用Reed-Muench法计算EID50。

1.2 主要试剂 TIANamp病毒RNA提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司；AxyPrep PCR清洁试剂盒和AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒购自爱思进生物技术(杭州)有限公司；Expand High Fidelity PCR System、dNTPs(10mmol/μL)等购自 Roche 公司；T4DNA连接酶、AMV反转录酶(10u/μL)、RNasin(40u/μL)购自Promega公司；pCR2.1载体购自Invitrogen公司；H9亚型F株禽流感灭活疫苗购自扬州威克生物工程有限公司(生产批号：1002003)。

1.3 引物设计和合成 参照文献[7]的方法设计反转录(RT)引物Uni12-primer(5'-AGCAAAAGCAG G-3')，参照GenBank中登录的AIV序列设计PCR引物H9HA-F(5'-AGCAAAAGCAGGGGWANTTCAC AA-3')和H9HA-R(5'-GCCAATTATATACAAATGTT GCATCTGC-3')。所有引物均由南京金斯特生物科技有限公司合成。

1.4 RT-PCR扩增HA基因 取140μL含病毒鸡胚尿囊液，用试剂盒提取病毒RNA。用Uni12-primer引物和AMV反转录酶进行cDNA合成，反应体系为30μL，RNA用量为500ng，42℃反应60m in。

取2μL cDNA进行PCR，反应体系为：10×Expand High Fidelity Buffer w ith 15mM MgCl25μL、dNTPs(10mmol/μL)1μL、Expand High Fidelity Enzyme M ix 1μL、RNasin 1μL、引物 H9HA-F和H9HA-R各25pmol，用纯水补足至总体积50μL。反应条件：94℃5min；94℃30s、60℃30s、72℃1.5m in；共30个循环，72℃8m in。

PCR产物用AxyPrep PCR清洁试剂盒和AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒进行纯化，再以T/A克隆的方法插于pCR2.1载体中。

1.5 HA基因的测序和遗传进化树绘制 含HA基因的重组质粒由南京金斯特生物科技有限公司测序。采用Lasergene 7.1软件进行HA基因序列编辑和翻译；用Mega4.0.2软件绘制遗传进化树。

1.6 F株灭活疫苗对分离株的免疫保护试验 将200只3周龄SPF鸡(种蛋购自北京梅里亚维通公司，自行孵化)随机分为20组，每组10只，隔离饲养；其中10组接种H9亚型F株禽流感灭活疫苗(0.3m L/只)，另外10组接种灭菌PBS(0.3m L/只)作为对照。21d后采集各组鸡的血清，测定血凝抑制(HI)抗体效价(以log2表示)；分别用9个分离毒株和F株经鼻腔途径攻毒，每个病毒株攻击疫苗接种组和对照组各1组，剂量为每只鸡106EID50/0.1m L。攻毒后第5d，采集喉头和泄殖腔拭子样品，每只鸡的样品接种3枚10日龄SPF鸡胚，37℃培养72h后测定每个鸡胚尿囊液HA价。分别统计各组鸡的排毒情况。

2 结 果

2.1 HA基因的序列分析 分别对9个分离株HA基因测序结果显示其编码区长度均为1683nt；同源性分析表明；9个分离株之间核苷酸序列同源性为90.7%～98.9%，推导氨基酸序列同源性为92.2%～98.8%；分离株与F株之间HA的核苷酸序列同源性为91.6%～99.6%，氨基酸序列同源性为92.9%～99.3%(图1)。遗传进化分析证实，9个分离毒株与F株均属于Beijing/1/94-like分支，但分属3个不同的基因亚型(图2)。

2.2 F株的免疫效果评价 3周龄SPF鸡接种H9亚型F株禽流感灭活疫苗21d后，产生的HI抗体效价在9Log2以上，对分离株及F株攻毒后的喉头和泄殖腔排毒产生明显的抑制作用(表1)。其中L9株、F9株、S9株、D9株、M株、D119株和F株攻毒后5d均未检出排毒，F119株、YD株、W 9株攻毒后5d的排毒率仅为1/10，而未接种疫苗的对照组攻毒后5d排毒率均为10/10。

表1 H9亚型禽流感灭活疫苗(F株)对9个分离株的免疫保护效果Table 1Protection efficacy of H9subtype F strain avian influenza inactivated vaccine against 9isolates

3 讨论

自上世纪90年代后期以来，H9N2亚型AIV在许多国家的家禽(特别是鸡群)中广泛流行。陆生家禽中分离的H9N2亚型AIV毒株有3个进化分支[4,8-14]：G1分支主要在鹌鹑中被发现(代表毒株是A/Quail/HongKong/G1/1997)；Y280分支在多种禽类中均有流行(代表毒株是A/Duck/HongKong/Y280/1997)，该分支也被称为Beijing/1/94-like(代表毒株是A/Chicken/Beijing/1/94)；Y439分支的代表毒株是 A/Duck/Hong Kong/Y439/97。3个分支的病毒在欧亚大陆家禽中流行，并进化为多个基因亚型。防控H9N2亚型AIV感染的重要措施是采用同亚型的疫苗进行免疫接种，但由于流感病毒易发生变异，必须掌握流行病毒株的变异情况。近年来，国内有报道认为当前流行病毒株已经发生了显著变化，现有疫苗已经不能产生完全免疫保护[15]。也有研究认为虽然H9亚型AIV发生了一定变异，但是现有疫苗仍能提供有效保护[16]。根据本研究对2009年～2010年期间从H9亚型F株禽流感灭活疫苗免疫鸡群分离的流行毒株所进行的HA基因测序分析，分离株HA基因核苷酸序列同源性为90.7%～98.9%，氨基酸序列同源性为92.2%～98.8%；分离株与F株HA之间的核苷酸序列同源性为91.6%～99.6%，氨基酸序列同源性为92.9%～99.3%。9个分离株又可以分为3个基因亚型，其中F9分离株与F株属于同一基因亚型，L9分离株与A/Chicken/Hong Kong/G9/97株属于同一基因亚型，另外7个分离株属于独立的一个基因亚型，表明当前H9亚型AIV流行毒株出现较大变异。但是，9个分离毒株与F株均属于Beijing/1/94-like进化分支，未发现G1-like和Y439-like分支，表明当前的流行毒株具有同一起源[4,6]，这对应用疫苗预防H9亚型AIV感染是有利的。

由F株制备的H9亚型禽流感灭活疫苗在国内的应用范围非常广泛。本研究发现F株对9个分离株均能提供很高的保护率，表明当前的流行毒株虽然在基因水平上发生了变异，但是并未造成太大的抗原性的变化，该结果与荣骏弓等和姜北宇等的结果一致[16-17]。尽管如此，由于流感病毒本身的易变异性，再加上疫苗广泛使用造成的免疫选择压力，H9亚型AIV的变异仍将继续，因此，今后仍需继续监测病毒的变异情况，为筛选新的疫苗毒株作好准备。

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