贵州省PRRSV分离株Nsp2基因的克隆及序列分析

刘 飞，王开功,*，周碧君,，罗险峰，文 明,，安同庆，刘春国，程振涛，路宪礼，陈 俊

(1.贵州大学动物科学学院，贵州贵阳550025；2.贵州省动物疫病研究室，贵州贵阳550025；

3.贵州省动物疾控中心，贵州贵阳550008；4.中国农业科学院哈尔滨兽医研究所，黑龙江哈尔滨150001)

猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)是由PRRS病毒(PRRSV)引起的一种高度传染性疾病。该病自1987年首次在美国被报道发生以来，迅速蔓延至各养猪国家，并造成了严重的经济损失，是目前危害养猪业的重要疾病之一[1-2]。1996年郭宝清等首次在国内分离到PRRSV，证实了该病在我国的存在[3]。PRRSV基因组长约15kb，有9个开放阅读框(ORF)[4-6]。其中ORF1a和ORF1b约占全基因组的80%，编码病毒RNA复制酶多聚蛋白，并在自剪切蛋白酶的作用下产生13个非结构蛋白(Nsp1α、N sp1β、N sp2～Nsp12)，其中Nsp2蛋白变异性很大[7-8]。

2006 年以来我国暴发了高致病性PRRS，病原为高致病性PRRSV(HP-PRRSV)，其主要分子特征为Nsp2蛋白存在30个氨基酸的不连续缺失，即第481位和533位～561位氨基酸缺失[2,9]。这一缺失特征普遍存在于2006年～2009年分离的HP-PRRSV中，并且高度保守[10]。迄今为止，仍无HP-PRRSV Nsp2蛋白发生进一步扩大缺失的报道。但是，通过对2007年～2009年贵州省不同地区的HP-PRRSV分离株的Nsp 2蛋白进行分析，我们发现部分HP-PRRSV的Nsp2蛋白缺失正在扩大。这些新缺失病毒株的出现，提示了HP-PRRSV可能出现了新的变异走向。

1 材料和方法

1.1 病毒样品和细菌株 2007年～2009年本实验室在贵州省的贵阳、花溪、遵义、毕节和铜仁等地区采集疑似PRRSV感染的临床样品12份，其中11份鉴定为阳性[11]；大肠杆菌感受态细胞DH5α株由本实验室保存。

1.2 主要试剂 AMV RTase购自上海生工生物工程技术服务有限公司；RNAiso Reagent、Taq酶等PCR试剂、PstⅠ和EcoRⅠ内切酶、pMD18-T载体均购自TaKaRa公司；胶回收试剂盒购自Omega公司；质粒提取试剂盒购自博大泰恒公司。

1.3 PRRSV Nsp2基因的扩增 参考GenBank中登录的HP-PRRSV的基因序列，在Nsp2基因内部的保守区设计1对引物：PNsp2-1：5'-CCTCCGTGGTG CAACAAATCTTG-3'； PNsp2-2： 5'-CGATGATGGCT TGAGCTGAGTAT-3'，扩增片段大小为1064bp。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

按照常规方法提取病毒RNA并进行RT-PCR扩增。PCR反应体系为 50μL：cDNA 5μL、10×PCR Buffer 5μL、MgCl2(25mmol/L)3μL、dNTPs(10mmol/μL)1μL、Taq DNA 聚合酶(2.5U/μL)1μL、上下游引物(20μmol/μL)各 1μL和灭菌双蒸水33μL。扩增条件为：94℃ 5m in；94℃ 30s、56℃ 30s、72℃ 45s，35个循环；72℃ 10min。PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳观察结果。

1.4 目的基因的克隆与鉴定 将目的基因片段胶回收后连接至pMD18-T载体中，并转化DH5α感受态细胞，涂布LB/Amp+/IPTG/X-gal平板，蓝白斑筛选后提取重组质粒DNA。经PCR、PstⅠ/EcoRⅠ双酶切鉴定，阳性重组质粒由TaKaRa公司测序。

1.5 Nsp2基因序列的比对分析 按照Cha等建立的方法进行Nsp2基因序列的分析[12]。采用LasergeneR7.0(DNAStar)和DNAMan软件，对贵州HP-PRRSV分离株Nsp2基因序列与GenBank登录的52株国内外代表性病毒株序列进行多重序列比对，采用MEGA4软件根据neighbor-joining方法绘制系统发生树。

2 结果

2.1 RT-PCR扩增结果 11份HP-PRRSV阳性病料样品的RNA经RT-PCR扩增后，凝胶电泳结果显示在约1kb处出现扩增条带，虽与预期的1064bp相近，但却存在大小不同的两条泳带。泳道10、11的片段比泳道1～8的稍小，在泳道9中同时存在这两种大小的片段，提示可能在同一份病料样品中同时存在两种不同缺失类型的PRRSV(图1)。

2.2 Nsp2基因片段的克隆与鉴定 将Nsp2部分基因片段的PCR产物连接至pMD18-T载体中，提取重组质粒进行PCR和PstⅠ/EcoRⅠ双酶切鉴定，选择阳性重组质粒进行测序。其中GZHW泳道的两条带分别切胶连接至pMD18-T载体中进行测序。结果显示GZHW的两条带分别为1064bp(GZHW 1)和977bp(GZHW 2)，表明病猪混合感染了2种Nsp2基因不同程度缺失的PRRSV。另外的10份样品中有7份样品(GZCJ、GZHX、GZDJ、GZJS、GZWB、GZKY和GZKB)的Nsp2基因扩增片段大小为1064bp，1份样品(GZZB)扩增片段为1061bp，2个样品(GZWM、GZLJ1)的扩增片段为977bp。12株病毒的序列已录入GenBank(EU140613～EU140624)(表 1)。

表1 HP-PRRSV贵州分离株信息Table 1The information of HP-PRRSV isolates of Guizhou area

2.3 Nsp2基因序列分析 将12株分离株的Nsp2基因序列与GenBank中登录的参考毒株VR2332、BJ-4等的序列进行多重比对显示：GZCJ等8株HP-PRRSV发生2处不连续缺失，缺失位置为2780bp～2782bp和2936bp～3022bp，共 90个碱基，与以JXA1为代表的HP-PRRSV缺失位置相同。GZHW 2、GZWM和GZLJ1同样发生2处不连续缺失，但缺失位置为2750bp～2839bp和2936bp～3022bp，共177个碱基，是一种新型Nsp2基因缺失型PRRSV株。GZZB株则发生3处不连续缺失，缺失位置为2519bp～2521bp、2780bp～2782bp和2936bp～3022bp，共93个碱基，也是一种新型缺失病毒株(图2)。

2.4 Nsp2氨基酸序列分析 将根据12株HPPRRSV贵州分离株Nsp2基因推导的氨基酸序列与VR2332、BJ-4株等比较显示：GZCJ等8株分离株Nsp2蛋白在第481位和533位～561位发生缺失，共缺失30个氨基酸，与2006年江西省分离的PRRSV JXA1株的Nsp2氨基酸缺失情况完全相同(图 3)；GZHW 2、GZWM 与 GZLJ1分离株 Nsp2蛋白缺失471位～500位和533位～561位，共59个氨基酸；GZZB分离株Nsp2基因缺失第394位、第481位和533位～561位，共31个氨基酸。

2.5 Nsp2序列的系统发生树分析 将PRRSV贵州分离株与其他地区PRRSV分离株的Nsp2氨基酸序列进行系统发生树分析。结果表明：贵州分离株与其他HP-PRRSV变异株(如JXA1、HuN4等)位于同一大的分支中，亲缘关系较近，而与国内2006年以前分离的经典病毒株的亲缘关系相对较远；同时，贵州分离株可分为两个小的分支，分支1与CBB-1-F3同源性最高，分支2与SX2009同源性最高(图4)。同源性分析结果显示：12株贵州分离株之间Nsp2核苷酸序列同源性为97.2%～100%，氨基酸同源性为94.9%～100%；与国内近来流行的变异株的核苷酸同源性为96.8%～99.3%，氨基酸同源性为93.8%～98.9%；而与早期国内外分离的经典病毒株的核苷酸同源性为75.1%～98.5%，氨基酸同源性为65.8%～97.7%。

3 讨论

通过对贵州省PRRSV分离株的序列分析表明，Nsp2基因不同程度的缺失是贵州省PRRSV变异的明显特征。在测定序列的12株分离株中，同一份病料样品中存在2种Nsp2基因不同程度缺失的PRRSV(GZHW 1和GZHW 2)，提示 PRRSV有进一步扩大缺失的趋势。

本研究12株分离株中共有3种不同缺失型：以GZKB株为代表的Nsp2蛋白30个氨基酸缺失型，即在氨基酸序列第481位和第533位～第561位发生2处共30个氨基酸不连续缺失。该型分离株为贵州省的主要流行类型，与2006年引起我国HP-PRRS的病毒株及国内其它地区分离株缺失位点完全一致[2]。该缺失特征为HP-PRRSV的重要标志，是判断PRRSV是否为高致病性病毒株的重要指标[13]，而本研究中12株PRRSV贵州分离株均为HPPRRSV。

以GZZB株为代表的Nsp2蛋白31个氨基酸缺失型，在30个氨基酸缺失型基础上，在第395位又缺失一个氨基酸。31个氨基酸缺失型为一种新型PRRSV Nsp2缺失型病毒株，但所占比例较小，不是贵州省的主要流行株类型。

以GZWM株为代表的Nsp2蛋白59个氨基酸缺失型，既在30个氨基酸缺失型基础上，在Nsp2蛋白的第481位氨基酸的两翼又缺失了29个氨基酸，是一种新的HP-PRRSV突变株。本研究中共分离3株该类型PRRSV，并且仅在贵州省分离获得。

研究表明，Nsp2蛋白是PRRSV非结构蛋白区域变异最大的，并且变异株间Nsp2保守性较差，抗原表位较多，而表位集中的区域容易发生缺失或突变[14]。由于PRRSV不断发生变异，对其基因序列进行遗传变异分析有助于设计和开发更有效的PRRSV诊断制剂，早期预警PRRS的发生和流行。本研究获得的新缺失型分离株，是否为适应性变异，能否承受内外环境的选择压力，有待于进一步调查研究。

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