浙江地区副猪嗜血杆菌分离株的生物学特性

何海健，陆国林，熊永忠

(1.金华职业技术学院农学院，浙江金华321007；2.浙江地区畜牧兽医局，浙江杭州310029；3.中国农业科学院哈尔滨兽医研究所，黑龙江哈尔滨150001)

副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis，HPS)病呈世界性分布，健康猪群中也存在HPS，是规模化猪场最常见的条件性细菌病[1]。近年来，HPS感染率呈明显上升趋势，给养猪业造成严重经济损失[2-4]。HPS为革兰氏阴性菌，该菌生长过程严格需要烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD或V因子)，因此又称NAD依赖型细菌[6]。HPS体外分离培养比较困难，主要侵害断奶后和保育阶段的仔猪，2周龄～4月龄仔猪均可发病，多见于5周龄～8周龄，表现为多发性浆膜炎、关节炎和脑膜炎[5]。本研究针对浙江地区HPS进行分离和生物学特性鉴定，明确浙江地区HPS病的流行特点。

1 材料和方法

1.1 菌株和实验动物 从浙江地区5个地(县)市的疑似多发性浆膜炎和关节炎病猪体内分离到6株细菌，分别命名为HPS1～HPS6；HPS标准菌株和15个血清型HPS标准菌的基因组DNA均由华南农业大学传染病教研室惠赠；200只清洁级昆明小鼠(18g～22g)购自浙江地区实验动物中心；8只清洁级豚鼠(200g～250g)购自浙江地区实验动物中心。

1.2 主要试剂 1kb Ladder DNA Marker购自Gibco BRL公司；Taq酶、1mg/m L NAD、小牛血清、TSA和TSB培养基均购自TaKaRa公司。

1.3 菌株选择与复壮 将分离菌株接种含NAD和小牛血清的TSA(4%)培养基，37℃培养18h后挑取单个菌落接种于含NAD和小牛血清的TSB(3%)培养基中，37℃振荡培养18h，4℃保存备用。

1.4 小牛血清对HPS生长的影响 将含NAD的TSB培养基分装为6管，每管5m L，依次添加小牛血依次为2%～10%，分别加入100μL HPS培养液，37℃培养18h，测定OD600nm值。

1.5 NAD对HPS生长的影响 配制含0.8m L小牛血清的TSB溶液，分装为7管，每管5m L，依次添加NAD至终浓度为1μg/m L～32μg/m L，分别加入HPS培养液100μL，37℃ 180r/min振荡培养18h，测定其OD600nm值。

1.6 培养时间对HPS生长情况的影响 将HPS于TSA培养基37℃培养，测定不同培养时间(12h～48h)对HPS生长情况的影响。

1.7 HPS生长曲线的测定 HPS复壮后，将6×103cfu接种TSB液体培养基，37℃培养12h，将培养液按培养基总体积的1%接种于TSB液体培养基内，37℃振荡培养，每隔2h平板菌落计数并测定培养基的OD600nm值，绘制HPS生长曲线。

1.8 小鼠致病力试验 参照寇式(Korbor)法测定其LD50，分别接种不同剂量的HPS1～HPS6，确定小鼠全部死亡或90%以上死亡的剂量和小鼠不死亡或10%以下死亡的剂量。在确定的最高、最低剂量范围为内，设置5组梯度剂量，腹腔注射感染小鼠，每组5只，同时设空白对照组。根据公式logLD50=∑1/2×(Xi+Xi+1)(Pi+1-Pi)计算 LD50，其中 Xi与 Xi+1及Pi+1与Pi分别为相邻两组的剂量对数以及动物病死率。

1.9 豚鼠致病力试验 将8只试验用豚鼠随机分为3组，设置2个试验组和1个对照组，试验组每组3只，对照组2只，参照文献[7]的方法，试验一组每只豚鼠腹腔注射1m L 1.0×109cfu/m L的HPS，试验二组每只豚鼠注射1m L 1.0×1010cfu/m L的HPS，对照组每只豚鼠注射1m L TSB。连续7d观察豚鼠的发病情况，每日心脏采血涂布TSA平板观察菌落生长情况，同时采用PCR方法检测HPS。一周内死亡的豚鼠，观察剖检变化并采集气管、肺、肝、脾、肾和脑组织直接进行PCR检测，病料经TSB培养基增菌培养后再次用PCR检测病原。7d后迫杀存活的豚鼠，观察脏器的变化，分离病原。

1.10 ERIC-PCR分型试验 参照文献[8]，ERICPCR引物为ERIC-1R：5'-ATGTAAGCTCCTGGGGA TTCAC；ERIC-2：5'-AAGTAAGTGACTGGGGTGAG CG。50μL体系ERIC-PCR反应条件为：95℃5min；94℃ 30s、50℃ 30s、72℃ 2m in，35个循环；72℃6min。PCR产物以1%琼脂凝胶电泳分析。

2 结果

2.1 不同浓度小牛血清和NAD对HPS生长的影响未加血清的对照组OD600nm值为0.399；血清浓度为2%～10%时OD600nm值在0.47～0.51之间，分别为0.479、0.481、0.500、0.476和0.510。表明，不同浓度小牛血清对HPS的生长影响较小，HPS培养基加入2.0%的小牛血清即可。

NAD浓度试验组结果表明，空白组中HPS未生长，其它各组OD600nm值与NAD浓度呈正比，NAD浓度大于16μg/m L时，OD600nm值进入平台期(表1)。因此，HPS培养基中加入16μg/m L NAD即可。

表1 NAD对HPS分离株生长的影响Table 1Effects of NAD on the grow th of isolates of H.parasuis

2.2 培养时间对HPS生长的影响 HPS接种TSA固体培养基12h内无肉眼可见的菌落，12h后菌落开始生长如针尖大小，12h～18h菌落大小为0.6mm～0.8mm，24h可长到1mm左右，然后逐渐长大，培养48h后HPS菌落长到最大值2mm左右。

2.3 HPS的生长曲线 HPS初始接种量为6×103cfu，接种于TSB液体培养基中培养，每隔2h进行平板计数、测定培养液的OD600nm值。

HPS在液体培养基接种4h左右，OD600nm值开始上升，在培养12h～24h之间OD600nm值达到峰值，随后呈下降趋势(图1)。

液体培养基中培养HPS，种子液接种后4h左右开始进入对数生长期，培养16h～18h培养基中的活菌数达到峰值，但从20h开始活菌数即下降，到25h～32h活菌数维持在同一个水平，但在32h之后，活菌数呈现下降趋势(图2)。

2.4 小鼠毒力试验 小鼠分别腹腔接种6株分离株后，均出现精神萎顿、被毛松乱和食欲减退等症状。接种12h后小鼠开始死亡，注射后观察14d，统计各组小鼠的病死率，计算LD50，HPS1～HPS6的 LD50分 别 为 2.03×109、5.3×109、1.34×1010、7.0×109、1.17×1010和 1.62×109。结果表明，HPS6的毒力最强，HPS3的毒力最弱。

2.5 豚鼠致病力试验 试验组豚鼠接种HPS6后，表现为被毛蜷缩，精神沉郁，心脏采血经培养表明，试验组5只豚鼠心血中均有细菌生长，对照组豚鼠心血中无细菌生长。试验一组豚鼠接种后，有一只可能因采血不当而死，其余一周内无死亡，试验二组的豚鼠分别于48h和72h各死亡一只。剖检两组死亡豚鼠发现，试验一组豚鼠各脏器病变不明显，只有肺脏有针尖大小出血点。试验二组豚鼠腹腔内有少量积液，胸腔内心包外面有层白色薄膜。其余豚鼠在接种一周后用迫杀，剖检，各脏器无明显病变，取各脏器样品进行PCR检测结果见表2。

2.6 HPS分离株ERIC-PCR检测结果 对分离到的HPS1～HPS6进行ERIC-PCR指纹图谱分析表明，HPS1和HPS6与血清5型标准菌株图谱一致，HPS2与血清9型标准菌株图谱一致，HPS4与血清4型标准菌株图谱一致，HPS3和HPS5与15个血清型标准菌株图谱不吻合(图3)。

3 讨 论

本实验中，首先预设添加NAD，探讨培养基中加入小牛血清的浓度对HPS生长的影响，结果表明，小牛血清对HPS的生长有促进作用，但受其浓度影响不大；进一步预设添加小牛血清，探讨NAD的浓度对HPS生长的影响，HPS对培养基的要求十分苛刻，一般营养肉汤几乎不生长，选择一种优良的培养基对于细菌的分离培养十分重要[9]。表明NAD是HPS生长的重要营养成分，细菌的生长浓度与NAD含量成正比，到16μg/m L后基本达到饱和。培养到18h左右达到活菌数的高峰，20h后开始下降，因此，以培养16h～18h的菌液为最佳。

研究表明，由于因源抗体的干扰，只有不吮食初乳的仔猪可以作为实验动物模型[10]。本研究测定了6株HPS浙江分离株对昆明小鼠的LD50，结果表明，HPS6的毒力最强，HPS3的毒力最弱。另外，对豚鼠进行了感染实验，两个剂量组6只豚鼠接种后有5只在心血中分离到HPS，高剂量组症状比低剂量组分离率高。结果表明，以小鼠和豚鼠作为HPS动物模型是可行的。Oliveiras证实ERIC-PCR指纹一致的菌株具有相同的血清型[11]。本实验对浙江地区内分离到的6株HPS进行了DNA指纹图谱分析。结果发现，有一株与血清4型标准菌株图谱一致，两株与血清5型标准菌株图谱一致，一株与血清9型标准菌株图谱一致，还有两株与15个血清型标准菌株图谱不吻合。实验结果表明，浙江地区内流行的HPS血清型比较复杂，除了常见的血清5型、4型和9型外，还存在其它不能确定血清型的菌株，提示不确定血清型菌株的存在有可能是HPS在一定地域内散发或者流行的根本原因。

表2 豚鼠致病力试验结果Table 2Pathogenic test of isolates of H.parasuis in guinea pig

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