血清9型鸭疫里默氏杆菌在华南地区的分离鉴定

冯金牛，陈芳艳，区德庆，阮二垒，杨丽云，黎丁滔，陈瑞爱，唐秀英，王林川,*

(1.华南农业大学兽医学院，广东广州510642；2.广东省大华农动物保健品股份有限公司，广东新兴527400；3.华南农业大学动物科学学院，广东广州510642)

鸭疫里默氏杆菌病是由鸭疫里默氏杆菌(Riemerella anatipestifer，RA)引起的接触性、传染性疾病，能够导致纤维素浆膜炎、干酪物渗出、输卵管炎和关节炎等主要病理变化[1]。其急性型表现为败血性急性死亡，慢性型一般无明显症状[2]。RA感染率和致死率高达10%～30%，甚至一些鸭场的死亡率高达75%，给养鸭业造成严重经济损失[3]。至今，RA感染已经成为制约东南亚肉鸭集约化生产的重要因素[4]。

根据16S rRNA基因序列对比分析，RA归类于黄杆菌科第五核糖体RNA总科[5]；并且通过玻板凝集和试管凝集鉴定，RA被分为21个血清型[6]，不同血清型间几乎无明显的交叉保护[7-8]。近年来，一些鸭场使用1、2型RA灭活苗的免疫效果不佳，而依赖大剂量使用化学药物成为目前防治该病的主要手段，但在临床病例中也不断出现耐药菌株，不能有效地预防和控制该病的发生[9]。2009年7月～2010年4月我们对广东、广西和福建等养鸭密集地区进行RA流行病学调查，分离、鉴定5株分离株，并进行16S rRNA部分基因扩增和序列分析，为该病的流行病学研究和疫苗的研制提供实验依据。

1 材料和方法

1.1 病料样品来源 病料样品来自于广东、广西和福建等养鸭密集的华南地区的5日龄～60日龄，患有典型鸭传染性浆膜炎病死的樱桃谷鸭、番鸭、麻鸭和丽佳鸭等。

1.2 主要试剂及设备 细菌基因组DNA提取试剂盒购自天根生物技术有限公司；DNA胶回收试剂盒购自Omgea公司；DNA Marker和PreM ix Taq均购自TaKaRa公司；TSA(Tryptic Soy Agar)培养基和TSB培养基购自北京陆桥生物技术有限公司；巧克力平板(50m L/L绵羊脱纤血的TSA平板)、葡萄糖、甘露糖、甘露醇、乳糖、蔗糖、硫化氢、尿素酶、明胶液化、西蒙氏枸橼酸盐利用等细菌生化微量鉴定管均购自杭州天和微生物试剂有限公司。

1.3 细菌的分离鉴定 用棉签蘸取病死鸭心脏、肝脏、脑组织，直接涂布绵羊血琼脂平板和麦康凯琼脂培养基，并置于蜡烛缸内37℃培养48h，观察细菌生长情况；挑取可疑菌落进行革兰氏染色镜检，并在绵羊血琼脂平板上纯化，纯化后的细菌接种到葡萄糖、甘露糖、甘露醇、乳糖、蔗糖、硫化氢、尿素酶、明胶液化、西蒙氏枸橼酸盐利用等细菌生化微量鉴定管内进行细菌生化特性检测。

1.4 动物回归试验 将60只15日龄非免疫雏鸭分为6组，每组10只。将所有分离株在巧克力平板上37℃培养18h。用生理盐水冲刮菌落，制备成9×109cfu/m L的菌液，实验鸭肌肉注射0.1m L/只。

1.5 血清型鉴定 委托美国康乃尔大学鸭病研究所采用玻板凝集试验和琼脂扩散试验进行鉴定。

1.6 引物与PCR鉴定 采用细菌的通用引物[10]扩增16S rRNA基因序列，正向引物为27：5'-AGAGT TTGATC(C/A)TGGCTCAG-3'；反向引物为 1492R：5'-TACGG(C/T)TACCTTGTTACGACTT-3'。反应程序为：94℃3m in；94℃1m in、50℃1m in、72℃2min，30个循环；72℃6min。

1.7 PCR产物的纯化、克隆及重组质粒的鉴定PCR产物纯化及与pMD18-T载体的连接分别参照各试剂盒的使用说明操作。连接产物的转化，阳性克隆的筛选按照文献[11]进行。将重组质粒转化DH5α，筛选出阳性重组质粒接种于5m L的LB液体培养基(含氨苄青霉素)中振荡培养过夜，取2m L菌液，用质粒抽提试剂盒抽提质粒，进行PCR重组质粒的鉴定。

1.8 核苷酸序列的测定及序列同源性比较 重组质粒由上海英骏生物技术有限公司进行核苷酸序列测定。测序结果与GenBank中登录的RA H-2565(AY871820)、P-2123(AY871822)、H-1785(AY871825)、H-2199(AY871826)、 大 肠 杆 菌 BL21(AJ605115)、多杀性巴氏杆菌PM 966(AY078997)、弯曲杆菌SVS3035(AF097690)、鸟乳杆菌LAV3(AB175728)、金黄葡萄球菌Kitami(D83354)、链球菌ChDCYS1(AY691533)和肠炎沙门氏菌SE22(U90318)的16S rRNA基因序列进行比较，利用DNAStar软件进行同源序列分析，并绘制遗传进化树。

2 结 果

2.1 细菌的分离与鉴定 将病料样品划线接种于麦康凯平板培养基上，无菌落生长；接种于绵羊血琼脂平板培养基上，培养24h后可见圆形、微凸起、湿润、光滑、灰白色、大小为1mm～2mm的菌落，采用折光观察可见菌落带有蓝色虹光；显微镜观察菌体呈杆状或椭圆状，大小为0.3μm～0.5μm×0.7μm～6.5μm，偶见个别为长丝状，11μm～24μm，多数为单个，少数呈双链或短链排列，革兰氏染色阴性的小杆菌。将细菌分离株分别命名为：D10、D21、X18、J9和 J33。

2.2 生化鉴定结果 将分离的5株菌株纯培养物分别接种于各种生化反应管，除精氨酸双水解酶和氧化酶反应全部阳性，以及D10和J9菌株明胶液化反应为阳性外，其他的生化反应均为阴性(表1)。

表1 细菌分离株的生化反应结果Table 1The biochem ical reactions of the isolates

2.3 动物回归试验 将分离株菌液接种非免疫雏鸭，24h后开始呈现精神沉郁、厌食、粪便呈黄白色蛋清样等早期临床症状；48h～72h出现头颈震颤、共济失调等神经症状。72h有50%试验雏鸭死亡，168h则全部死亡。剖检以心包炎、肝周炎、气囊炎和脑膜炎为主要病变；另外，可见心脏肿大、心包积液、心包膜有灰白色纤维素渗出物；肝脏和脾脏肿大、钝圆，肝脏表面有灰白色纤维素渗出物；胸、腹部气囊混浊，表面有点状浅黄色纤维素渗出物，并逐渐钙化。能够从死亡雏鸭的肝脏、血液和脑中分离出相同的细菌株。

2.4 血清型鉴定 经玻板凝集试验和琼脂扩散试验鉴定5个分离株均为血清9型RA。

2.5 PCR扩增结果 分别以5个分离株基因组DNA为模板，进行PCR扩增，结果显示在约1400bp处有扩增条带，与预期(1429bp)相符(图1)。

2.6 测序及同源性比较 测序结果表明，5株分离株基因序列大小相同。经序列比对表明：分离株D10、D21、X18、J9和 J33与 GenBank中登录的RA 16S rRNA序列相似性较高，为99.1%～99.7%。其中 D10、D21、X18、J9和 J33与标准株 H-1785的同源性分别为99.6%、99.7%、99.4%、99.6%和99.6%；与标准株H-2199的同源性分别为99.6%、99.7%、99.4%、99.6%和99.6%；与标准株H-2565的同源性分别为99.3%、99.4%、99.1%、99.3%和99.3%；与标准株P-2123的同源性分别为99.6%、99.7%、99.4%、99.6%和99.6%；与其他相关细菌株16S rRNA序列同源性为73.7%～75.9%；5株分离株间16S rRNA序列同源性为99.4%～100%(图 2)。

分离株D10、D21、X18、J9和J33与GenBank中登录的RA 16S rRNA系统进化分析表明：分离株与标准株H-1785、H-2199、H-2565和P-2123的16S rRNA亲缘关系较近，与其他RA菌株的16S rRNA亲缘关系较远(图3)。

3 讨论

据报道，RA至少有21个血清型，不同血清型间很少有交叉保护[6,12]。在我国RA同样呈现多型性：张大丙等在对RA血清型调查中先后分离到血清 2、6、10、11、13、14、15和 17型[13]；程安春等针对我国RA血清型调查发现血清1～8、10、11、13、14型以及新型血清型[14]。本研究在对华南地区RA流行病学调查中首次分离到9型RA。并通过对该5株9型RA华南分离株的16S rRNA基因扩增和序列分析，进一步鉴定并明确该5株分离株的分类地位。

Subramaniam等通过对4株RA及相关RA的16S rRNA基因序列进行比对发现，4株RA的同源性为0.51%～1.0%，并且处于系统发生树同一株枝的不同分枝上[15]。而本研究的结果表明：华南分离株均属于9型RA，并且菌株间16S rRNA序列同源性为99.4%～100%。本研究将5株华南分离株与GenBank中登录的标准株进行16S rRNA系统进化分析，表明5株分离株与标准株H-1785、H-2199、H-2565和P-2123的16S rRNA序列亲缘关系较近，之间有一定的差距但不超过1%，与其他菌株16S rRNA序列亲缘关系较远。本研究首次分离到血清9型RA，表明我国RA病的血清型更加复杂，并为进一步防治该病提供了实验依据。

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