缺失rfaH基因的鸡白痢沙门氏菌株的构建及鉴定

康 凯，陈小云*，张 敏，李伟杰，王凤国，梁达雪，陈瑞爱

(1.中国兽医药品监察所，北京100081；2.广东大华农动物保健品有限公司，广东云浮527400)

鸡白痢沙门氏菌(Salmonella pullorum)，多侵害20日龄以内雏鸡，引起雏鸡急性败血症，日龄较大的雏鸡可表现为白痢。其发病率和致死率较高，给养鸡业造成严重的经济损失，对人类的健康也存在一定的威胁[1-2]。

根据沙门氏菌菌落特点，可将其分为光滑型和粗糙型，而两者无血清学交叉反应。目前发现的S.pullorum野毒株均为光滑型菌株，因此，筛选重组粗糙型S.pullorum作为研制疫苗用菌株，是鸡白痢DIVA(区分感染动物与疫苗免疫动物)疫苗的理想候选株。

由rfaH基因编码的RfaH蛋白是一种抗转录终止蛋白[3-4]。在鼠伤寒沙门氏菌中，该蛋白可以影响LPS核心区和O抗原的表达[5]，而O链缺失会导致光滑型转变为粗糙型。由此推测，去除S.pullorum rfaH基因可以将其变为粗糙型菌株，并实现减毒效果。本研究利用自杀质粒的同源重组，敲除rfaH基因，获得不含外源分子标记及遗传稳定的粗糙型S.pullorum候选疫苗株。

1 材料和方法

1.1 菌株、质粒、血清和实验动物 S.pullorum CVCC 79201株由中国兽医药品监察所保存及鉴定；自杀质粒pKNG101购自荷兰微生物菌种保藏中心；抗S.pullorum阴、阳性血清由本实验室制备；伊莎褐蛋鸡购自广东省新兴县种鸡场。

1.2 主要试剂和仪器 T4DNA连接酶、Taq酶、各种限制性内切酶等均购自TaKaRa公司；细菌基因组提取试剂盒、琼脂糖凝胶回收试剂盒购自TIANGEN公司；电转化仪购自美国Bio-Rad公司。

1.3 引物 按照S.pullorum 287/91株(NC_011274)的基因序列，设计扩增沙门氏菌rfaH基因上、下游同源重组序列，以及rfaH基因缺失后的检测引物(DrfaH-U/DrfaH-L)(表 1)。

表1 PCR引物序列Table 1Primers used to generate different fragments for the construction of homologous recombinant plasm ids

1.4 同源重组序列的克隆及重组自杀质粒的构建按照细菌基因组提取试剂盒说明书的方法，提取S.pullorum基因组DNA并扩增上、下游同源重组序列：94℃ 5min；94℃ 40s、54℃ 40s、72℃1m in，31个循环；72℃10min。扩增产物用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收。XhoⅠ酶切后，克隆至pMD18-T载体中，筛选获得重组质粒pMD-rfaHUL，通过SalⅠ和ApaⅠ克隆至自杀质粒pKNG101中，获得用于同源重组的自杀质粒pKNG-rfaHUL。将pKNG-rfaHUL分别用XhoⅠ、SalⅠ和ApaⅠ进行酶切鉴定及序列测定。

1.5 S.pullorum rfaH基因的敲除 采用甘油方法制备感受态S.pullorum，并与pKNG-rfaHUL混匀电击。加入预热的普通肉汤培养基，37℃150r/min摇振培养2h后，将菌液涂布于含50μg/m L链霉素的普通琼脂培养皿上，37℃培养24h。筛选抗性菌落，即为重组菌。增菌培养后，利用自杀质粒带有的SacB蔗糖敏感基因，在含5%蔗糖的LB平皿上，筛选耐蔗糖，即为rfaH基因缺失菌。

1.6 rfaH基因缺失S.pullorum的鉴定 挑取单个菌落，接种到普通肉汤培养基中，37℃振荡培养16h，提取细菌基因组DNA。以DrfaH-U和DrfaH-L为引物，进行PCR扩增，产物克隆至pMD18-T中测序(北京三博远志生物工程技术有限公司)。将阳性的重组菌命名为rSp。

对rSp分别进行吖啶黄凝集试验、菌落结晶紫染色和沉降速度试验，同时以亲本株CVCC79201株作为对照。

1.7 传代稳定性检测 将rSp在培养基上传代培养15代，以1.6中方法分别检测rSp的缺失基因和粗糙型特性，确定其传代稳定性。

1.8 rSp抗原及抗血清的血清学反应特性 用rSp和CVCC 79201制备抗原，分别与抗鸡白痢阴、阳性血清进行平板凝集试验；同时将rSp和亲本株CVCC79201分别皮下免疫S.pullorum抗原和抗体阴性的伊莎褐蛋鸡，2周后分离rSp和亲本株CVCC 79201抗血清，分别与鸡白痢鸡伤寒多价染色平板抗原进行平板凝集试验，确定rSp抗原及抗血清的反应特性。

2 结果与讨论

2.1 重组自杀质粒的鉴定 将筛选获得的重组自杀质粒pKNG-rfaHUL分别用XhoⅠ、SalⅠ和ApaⅠ进行酶切鉴定，结果与预期一致。测序结果表明，rfaH基因上、下游同源重组序列正确插入自杀质粒pKNG101中，并且序列正确。

2.2 重组效率鉴定 感受态细菌菌落计数，浓度为1.7×109cfu/m L；2.5μg pKNG-rfaHUL质粒转化50μL CVCC79201感受态细胞24h后，由链霉素普通琼脂平皿上获得9个菌落，排除因电击死亡的细菌，重组率约为5.3×10-9。

2.3 重组菌的PCR鉴定 以DrfaH-U和DrfaH-L为引物，进行PCR扩增，同时以亲本株CVCC 79201基因组DNA作为对照。PCR产物经凝胶电泳(图1)和序列测定，结果均与预期一致，即重组菌因缺失rfaH基因，PCR产物大小约为336bp，而以亲本株CVCC79201基因组DNA为模板的PCR产物中，包含了完整的rfaH基因，大小约为835bp。

2.4 基因缺失菌株的表型鉴定 rSp的吖啶黄凝集试验、菌落结晶紫染色和沉降速度试验结果显示：吖啶黄凝集试验阳性，能够被结晶紫染色，细菌沉降速度明显快于光滑型沙门氏菌，符合粗糙型S.pullorum的特点。

2.5 rSp传代稳定性检测结果 rSp在普通培养基上连续传15代后，以DrfaH-U和DrfaH-L为引物的PCR产物大小为336bp，序列测定结果与初代相同，表明重组菌具有良好的传代稳定性。

2.6 rSp的血清学反应特性 rSp抗原与抗鸡白痢阴、阳性血清均不发生凝集反应，而CVCC79201抗原可凝集鸡白痢阳性血清，与阴性血清不发生反应。rSp抗血清与鸡白痢鸡伤寒多价染色平板抗原不反应，而亲本株CVCC79201抗血清能够与该抗原发生凝集反应(表2)。因而以该重组菌株制备的疫苗免疫动物后，不会对非重组菌感染的检测产生干扰，为用rSp生产疫苗综合防治鸡白痢提供了可能。

表2 rSp和CVCC79201抗原及抗血清的平板凝集反应结果Table 2Plate agglutination test of rSp and CVCC79201antigen w ith anti-serum

2.7 关于高效自杀性载体系统的同源重组 染色体基因重组技术基本原理是构建含一定长度同源DNA片段的重组自杀质粒，利用宿主自身的重组系统与同源重组序列交换，而经两次重组过程最终完成重组。这种重组技术可直接对宿主染色体进行修饰，并在多种革兰氏阴性菌中得到应用。目前，高效自杀性载体系统和Red同源重组系统均能够对革兰氏阴性菌染色体直接进行修饰，但Red同源重组系统将在染色体中残留FRT位点，而自杀性载体系统在染色体中除目的基因外，不保留任何外源DNA。利用该技术可以获得具有完全生物安全意义的重组S.pullorum疫苗株，从而满足我国对鸡白痢防治的需要。

[1]沙莎，孙裕光，王琴.我国鸡白痢沙门氏菌病诊断与防治研究概况[J].西南民族学院学报，2003，29(2)：190-195.

[2]成进，沙依然古丽.鸡伤寒白痢沙门氏菌灭活菌苗的研制[J].西北农业学报，2000，9(1)：20-23.

[3]宋厚辉，王志亮，杜文金，等.鸡沙门氏菌弱毒苗的安全性和免疫效力试验[J].中国兽医学报，2000，3：202-204.

[4]Bailey M J,Hughes C,Koronakis V.RfaH and the ops element,components of a novel system controlling bacterial transcription elongation[J].Mol M icrobiol,1997,26(5):845-851.

[5]Nagy G,Danino V,Dobrindt U,et al.Down-regulation of key virulence factors makes the Salmonella enterica serovar Typhimurium rfaH mutant a prom ising live-attenuated vaccine candidate[J].Infect Immun,2006,74(10):5914-5925.