猪源耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的耐药性及其SCCm ec基因分型研究

王 新，黄 山，周 婷，刘俊宁，杨保伟，席美丽，申进玲，只 帅，孟江洪

(1.西北农林科技大学食品学院，陕西杨凌 712100；2.四川省石棉县畜牧局，四川石棉625400；3.西北农林科技大学动物医学院，陕西杨凌71210)

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(Methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA)是导致医院或社区获得性感染的重要病原菌之一[1]。MRSA不但对甲氧西林耐药，而且对临床使用的多种抗生素呈交叉耐药和多重耐药，是临床抗感染治疗的难题之一。MRSA耐甲氧西林主要是获得了外源性mecA基因，该基因编码青霉素结合蛋白2a，造成对β酰胺类药物耐药。mec基因位于金黄色葡萄球菌(SA)染色体基因盒(Staphylococcal cassette chromosome mec，SCCmec)上，该元件还携带了除mecA基因外的其他抗生素耐药基因，这是造成多重耐药的重要分子基础[2-4]。医院感染MRSA基因型多为SCCmecⅠ、Ⅱ、Ⅲ型，具有多重耐药特点，除携带mecA基因外还带有其他耐药基因；而社区获得性的MRSA菌株基因型多为Ⅳ型和Ⅴ型，SCCmec-Ⅳ型又分为a、b、c、d 4个亚型，SCCmecⅣ和Ⅴ型基因盒较短，除了携带mecA基因外几乎不带有其他耐药基因，具有对非β-内酰胺类的抗菌药物敏感特点，提示SCCmec基因分型可以区分医院和社区感染的MRSA[2,5]。最近报道了MRSA在猪和人之间传播，所以猪源MRSA引起了全世界的广泛的关注[1,6]。本研究通过调查陕西猪场MRSA的流行情况、耐药谱特征及其SCCmec基因分型，初步了解陕西猪群中MRSA的耐药特点及分子流行病学特征，为生猪及其产品安全风险评估提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 样品及标准菌株来源 从2009年1月～7月，采集陕西省6个规模化猪场的鼻腔拭子共计173份；质控菌株SA ATCC29213，大肠埃希菌ATCC25922来源于本实验室保存。

1.2 主要试剂 Baird-Parker琼脂培养基，胰酶大豆肉汤/琼脂，购自北京陆桥技术有限责任公司；万古霉素(VAN)，四环素(TET)，环丙沙星(CIP)，庆大霉素(GEN)，红霉素(ERY)，苯唑西林(OXA)，头孢西丁(FOX)，氯霉素(CHL)，甲氧苄啶(TMP)，阿米卡星(AMK)，头孢哌酮(CFP)等11种抗生素均购自Sigma公司；dNTPs、Taq DNA聚合酶及100bp Marker，均购自宝生物工程(大连)有限公司。

1.3 SA及MRSA分离及鉴定 将采集的猪鼻腔拭子浸出液接种于含7.5%NaCl TSB肉汤中，37℃培养24h，接种到Baird-Parker Agar平板中，37℃培养24h，每个可疑样品挑取2个菌落，进行纯化培养。nuc基因和mecA基因参照文献[7]进行二重PCR反应，PCR产物进行电泳检测，鉴定出SA或MRSA。

1.4 PCR扩增引物 二重PCR引物参照文献[7]，确定SA或MRSA。多重PCR分型引物参照文献[2]的方法确定SCCmec基因型，引物由宝生物工程(大连)有限公司合成(表1)。

表1 HBF-1分离株的发病规律Table 1Disease regulation of HBF-1in fox

1.5 DNA的提取 挑取纯培养细菌加入500μL双蒸水的1.5m L离心管中，混匀。煮沸20m in，12000r/m in离心5m in，取上清液，-20℃保存备用。

1.6 SCCmec基因分型检测 SCCmec基因分型采用多重PCR，引物、反应条件参照文献[6]。

1.7 MRSA耐药性检测 参照CLSI[8]指导说明进行琼脂平板稀释法测定菌株抗生素敏感性试验。OXA最低抑菌浓度(M IC)≥4μg/m L为 MRSA，≤2μg/m L为甲氧西林敏感SA(MSSA)。FOX最低抑菌浓度(M IC)≥6μg/m L为MRSA，≤4μg/m L为MSSA[9]。

2 结果与讨论

2.1 分离鉴定SA及MRSA 173份猪鼻腔拭子通过选择培养基培养和PCR鉴定定出83株SA，其中14株(13株对OXA耐药和1株对OXA敏感)为MRSA；6个猪场中有2个猪场分离到MRSA，然而在猪群中的感染率为8.1%(14/173)，与其他地区监测的猪群感染结果(24.9%)比较[10]，发生率较低，但值得注意的是14株MRSA菌株都来自两个规模化猪场，在这两个猪场分离的SA均为MRSA菌株，这可能与各个猪场用药方式不同，产生耐药的不均一性有关(表2)。

对分离的83株SA，采用OXA和FOX进行MRSA鉴定，分别确定出 13株和 14株 MRSA，FOX琼脂稀释法与PCR检测结果一致(表2)，这与Swenson等报道使用FOX优于使用OXA鉴定MRSA一致[9,11]。

表2 陕西地区猪场SA及MRSA的测结果Table 2Prevalence of isolates of SA and MRSA from 6large-scale sw ine farms in Shaanxi province

2.2 MRSA SCCm ec基因分型及抗菌药物耐药性猪源MRSA对11种常见抗生素耐药性，表现出多重耐药的特点，除对CFP、CHL、AMK和VAN敏感外，对CIP、OXA耐药率分别为57.1%和92.9%；对FOX、TET、ERY、甲氧嘧啶和GEN的耐药率都为100%。14株MRSA的SCCmec基因型均为SCCmecⅣb型，尚未发现其它SCCmec基因型，表明本地区猪场可能主要流行SCCmecⅣb型MRSA株，并具有多重耐药特点(表3)。与徐等报道的人源SCCmecⅣ型MRSA菌株药物敏感性存在较大差异[6,13]，揭示我们不能单独采用SCCmec基因型解释其耐药性的特点[2,5]，表明本地区猪源MRSA可能存在其它耐药机制，还将有待进一步研究证明，这一结果提示着公共卫生和人类健康又将面临新的挑战，应警惕猪源MRSA通过猪及其产品感染人。

表3 MRSA菌株对11种抗生素的耐药谱Table 3Percentages of 14MRSA isolates resistant to antibiotics

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