乳糖酶固态发酵法制备影响因素分析

康福忠，张 勇，王立红，董惠锋，刘鼎阔*

（1.天津市兽药饲料监察所，天津 300402；2.鼎正动物药业（天津）有限公司，天津 300402）

乳糖酶在食品、医药、养殖饲料等方面具有广泛的应用价值，但由于受乳糖酶发酵工艺的复杂性限制，致使其并未能够得到大规模的生产和使用。本试验利用亮毛霉固态发酵法产生乳糖酶，分析不同条件对其产酶效果的影响，确定了固态发酵法产酶的最佳工艺路线，以期为乳糖酶的生产奠定理论基础。

1 试验材料

1.1 仪器设备

J-25型高速冷冻离心机、DL201型恒温自动干燥箱、BS-2F恒温振荡培养箱、HZQ-F160全温振荡培养箱、磁力搅拌器、JA2003电子天平、DZKW-C型水浴锅、蒸气消毒器、Delta 320 pH计。

1.2 试验材料

亮毛霉（购自中国兽医药品监察所）、酵母粉、蛋白胨、琼脂粉、葡萄糖等。

2 试验方法

2.1 固体培养基制备

将麸皮和蒸馏水、黄豆粉和蒸馏水、玉米粉和蒸馏水分别按1：1混合放入250 mL三角瓶中，其中固体物质定量为10 g，搅拌均匀，分别作为基础培养基1、2、3。进行高压灭菌，冷却后制备菌悬液，将已接种的三角瓶放入30℃的恒温培养箱中进行3～5 d培养。

2.2 粗酶液的制备

用8倍体积的水浸提发酵过的麸皮，并匀速搅拌30 min。经4层纱布过滤后即得粗酶液，静置取上清液保存备用。

2.3 乳糖酶提取

硫酸铵分级沉淀法：将硫酸铵烘干研细，取200 mL上清液，向其中缓慢加入硫酸铵粉末至其浓度达20%， 4℃ 静置2 h，4℃，7 000 rpm离心 15 min），沉淀溶于 0.005 mol·L-1、pH 6.28 的磷酸盐缓冲液，测定酶活力。上清液继续加入硫酸铵粉末至浓度达40%，静置离心，沉淀溶于缓冲液，测定酶活力。

2.4 固体培养的单因素试验

2.4.1 确定最佳碳源

在基础培养基中以0.04 g·mL－1的比例加入葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、乳糖、可溶性淀粉，制备菌悬液接种培养，观察培养情况，并测定酶活力以确定最佳的外加碳源。

2.4.2 确定最佳氮源

在基础培养基中以0.02 g·mL－1的比例加入蛋白胨、酵母膏、牛肉膏、氯化铵、硝酸铵，制备菌悬液接种培养，观察培养情况，并测定酶活力以确定最佳的外加氮源。

2.4.3 无机盐

在选中的基础培养基中分别按0.1%的比例加入ZnCl2、Al2（SO4）3、CaCl2、FeCl2、CuSO4、MnSO4、KH2PO4，制备菌悬液接种培养，观察培养情况，并测定酶活力。

2.4.4 固液比

培养基的固液比分别为 1： 0.5、1：1、1： 1.5、1：2、1：2.5，在其中接入21 mL孢子悬液，观察培养情况，并测定酶活力以确定最佳的固液比。

2.4.5 改变接种量

在基础培养基中，分别接菌悬液0.5、1、1.5、2、2.5 mL，制备菌悬液接种培养。观察培养情况。并测定酶活力以确定最佳的接种量。

3 结果与分析

3.1 基础培养基的选择

不同基础培养基对乳糖酶产量的影响见图1。

图1 不同基础培养基对乳糖酶产量的影响

由图1可知，用麸皮和水的基础培养基培养实验室霉菌产生的乳糖酶活力最高，并且麸皮价格低廉，来源稳定，在未来扩大化培养和乳糖酶工业化生产中也适合作为基础培养基。大豆粉和玉米粉在加入水发酵培养后容易形成黏稠固形物，不适合后期乳糖酶的分离提取。故麸皮最适合亮毛霉进行固体培养。麸皮之间的空隙较大，有利于氧气的流通，适合进行固态培养。

3.2 外加碳源对乳糖酶产量的影响

外加碳源对乳糖酶产量的影响见图2。

碳源是菌体细胞组成的原料，也是菌体生长发育必需的能源物质。某些碳源是酶的诱导物，选择适宜的碳源有利于定向促进某些酶的合成，提高相应酶的产量[1]。

由图2可知，麦芽糖、蔗糖对乳糖酶的生成都无明显作用，可溶性淀粉和葡萄糖对乳糖酶的生成有一定抑制作用，而乳糖的加入则略微促进了乳糖酶的生成。符合乳糖操纵子学说，因此选择乳糖作为乳糖酶固态发酵生产的外加碳源。

3.3 外加氮源对乳糖酶产量的影响

外加氮源对乳糖酶产量的影响见图3。

图2 外加碳源对乳糖酶产量的影响

图3 外加氮源对乳糖酶产量的影响

氮是组成细胞蛋白质和核酸的主要元素之一。通常分为无机氮源和有机氮源，不同的氮源对产酶能力有不同的影响，一般来说，有机氮源对菌体的生长产酶较为有利，而菌体对无机氮源的利用则较差[2]。由图3可知，外加氮源中，3种有机氮源的加入都对乳糖酶的产生起到促进作用，其中蛋白胨的效果最明显。而无机氮源，在一定程度上抑制了乳糖酶的产生。故外加氮源选择蛋白胨比较合适。

3.4 不同无机盐的添加对乳糖酶产量的影响

无机盐对乳糖酶合成的影响见图4。

除了碳源和氮源外，一些常量元素和微量元素也影响菌体的生长和酶的形成[3]。

图4 无机盐对乳糖酶合成的影响

由图4可见，培养基中添加KH2PO40.1%时最有利于乳糖酶的产生。ZnCl2和CuSO4的加入抑制了乳糖酶的产生。因此选取KH2PO4添加入固态发酵培养基以增加乳糖酶的产量。

3.5 固液比对乳糖酶产量的影响

培养基固液比对乳糖酶产量的影响见图5。

图5 培养基固液比对乳糖酶产量的影响

固液比不同，相应的乳糖酶的产量也不同。当加水量过低时，水分缺乏，不足以提供微生物生长所必需，故菌体生长缓慢，相应的产酶量较低；当加水量过高时，水分过多，不利于空气的流通，影响酶的产量。由图5可知，随着固液比的增高，乳糖酶活力先增后减。其中当固液比为 1：1.5时，乳糖酶产量最高。

3.6 接种量对酶产量的影响

接种量对乳糖酶产量的影响见图6。

图6 接种量对乳糖酶产量的影响

由图6可知，在一定范围内酶的产量随着接种量的增加而增加，这个范围的临界点为10%～15%。故接种量在这个临界点附近时，酶的产量相对较高。

4 小结

乳糖酶在食品、医药、饲料等领域中的应用具有广阔的前景，已经成为生物领域新的热点之一，但由于乳糖酶的生产、纯化等过程比较困难，所以一直以来乳糖酶未能得到广泛应用。固态发酵工艺是一门很古老的技术，已在众多的领域得到应用，利用固态发酵进行各种酶类的生产已经成为常用的技术手段。所需的设备简单，便于生产，各领域上都得到了很大发展。随着人们对固态发酵机理认识不断加深，固态发酵中存在的一些问题也有望逐步得到解决和完善，使利用固态发酵技术进行酶的大规模生产完全成为可能。尤其在能源危机和环境问题日益突出的今天，固态发酵作为一种绿色生产工艺，将会有更加广阔的应用前景。现代固态发酵技术的进步也将促进工业发酵水平的不断完善与提高，使工业化生产向着绿色、环保、安全的方向发展。

[1]姚跃飞,曾柏全.现代固态发酵技术在食品加工业中的应用[J].食品与机械,2005（6）:89-92.

[2]俞俊裳.新编生物工艺学[M].北京:化学工业出版社,2003.

[3]李兴峰.乳糖酶高产菌株分离筛选、发酵产酶及酶学性质的研究[D].保定:河北农业大学,2004.