青岛文昌鱼促甲状腺激素受体(TSHR)蛋白的融合表达及鉴定

董 娟,辛 明,赵博生

(山东理工大学生命科学学院,山东 淄博 255049)

促甲状腺激素受体(the thyrotropin receptor,TSHR)属于G蛋白偶联受体家族[1].它与促甲状腺激素特异性结合来调节甲状腺细胞的成长、增殖和分化[2],通过第二信使cAMP[3],激活磷脂酶C和蛋白激酶A信号转导系统.近年来研究发现TSHR除在甲状腺细胞中表达外,还在淋巴细胞、脂肪细胞、肌纤维细胞表面及生殖腺等[4-5]组织细胞有表达.TSHR胞外域突变,可引发AITD疾病[6-7].文昌鱼属于脊索动物门头索亚门,处在无脊椎动物向脊椎动物进化的关键位置,是研究脊索动物演化和胚胎发育的模式动物,在比较基因组学和发育同源性研究中有重要作用[8].关于文昌鱼内柱和脊椎动物甲状腺之间的同源性获得了多方面证据支持:内柱可以同甲状腺一样代谢碘产生的碘化甲状腺氨酸,而且能合成相似的甲状腺球蛋白和过氧化物酶等[9].

本文通过构建文昌鱼TSHR基因的原核表达载体,得到融合表达蛋白,为以后研究该蛋白的性质、功能、与其相互作用蛋白以及脊椎动物甲状腺的起源问题提供一定的实验基础.

1 材料与方法

1.1 材料

重组质粒pcDNA3-TSH R为本实验室构建;pGEX-4T-1载体购自Promega公司;E.coliDH5α为实验室保存菌种;T aq聚合酶、BamHI、XhoI、DNA回收纯化试剂盒、蛋白分子质量标准等均购自TAKARA公司;兔抗人促甲状腺激素受体蛋白购自北京赛驰生物科技有限公司.

1.2 实验方法

1.2.1 pGEX-4T-1-TSHR重组质粒表达体系的构建

根据青岛文昌鱼TSHR基因,设计带有酶切位点的特异性引物,由上海生工生物技术公司合成.上游引物序列5'CGGGATCCTGCTGCT TACC 3'(下划线表示BamHI酶切位点),下游引物序列5'CCCTCGAGGGTCAAGTGAACCAGTC 3'(下划线表示XhoI酶切位点).以pcDNA3-TSHR质粒为模板,加入合成的引物进行PCR扩增.用BamHI和XhoI分别对PCR得到的TSHR基因片段与pGEX-4T-1载体进行双酶切,将酶切产物经1%琼脂糖电泳后,用TAKARA公司DNA回收试剂盒分别回收,T4连接酶16℃连接过夜.连接产物5μ L转化入感受态大肠杆菌DH5α.将转化后的DH5α涂布于含100 μ g/mL Amp+的LB平板,37℃培养16 h,挑取菌落,提取重组质粒,用TSHR基因的特异性引物进行PCR鉴定.并使用BamHI和XhoI进行双酶切鉴定,将鉴定正确的质粒送上海博尚生物公司测序,阳性重组质粒命名为pGEX-4T-1-TSHR.

1.2.2 重组质粒pGEX-4T-1-TSH R的诱导表达

含重组质粒pGEX-4T-1-TSHR的大肠杆菌DH5α过夜培养,以此为种子菌接种在含有氨苄青霉素的LB培养基中,37℃,250 r/min振荡培养至A600接近0.6时,加入1mmol/L IPTG,并在诱导2h、3h、4h、5h时收集菌液1mL,离心收集细菌沉淀,用转化pGEX-4T-1载体的DH5α和未转化载体的DH5α作为对照,进行SDS-PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)分析.

1.2.3 Western blot分析

12%的SDS-PAGE凝胶电泳后,转PVDF膜,5%的BSA在37℃封闭2h;PBST室温洗膜,加入兔抗TSH R多克隆抗体(1:300),于4℃孵育过夜;PBST室温洗膜,加入辣根过氧化酶标记的羊抗兔二抗(1:1000)37℃1 h,PBST室温洗膜,加底物DAB显色.

2 结果

2.1 TSHR基因的PCR扩增及重组质粒鉴定

用PCR基因扩增法得到含有BamHI和XhoI酶切位点的TSHR基因片段,结果为一条1700 bp左右的条带,与目的基因大小相符(图1).通过对转化后筛选得到菌株,提取重组质粒,进行PCR扩增得到一条与目的基因的大小一致,约1700 bp大小的条带(图2);双酶切鉴定得到两条分别为1700 bp和4900 bp的条带(图2),分别与目的基因和线性化质粒pGEX-4T-1的大小相一致.并且测序结果在NCBI网站进行blast比对,发现序列完整正确.说明目的基因片断已成功连接到表达载体上,表达载体构建成功.

图1 PCR得到含有BamHI and XhoI酶切位点的T SHR基因片段

2.2 重组蛋白的表达及鉴定

含有重组质粒pGEX-4T-1-TSHR的工程菌经1mmol/L IPTG诱导后,经SDS-PAGE分析,在76 kDa处有一条条带,而对照空载体和空菌的诱导在此位置没有条带(图3).根据DNASTAR软件模拟分析得出TSHR蛋白分子量约50 kDa,而GST大小约为26kDa,与SDS-PAGE分析的大小一致.说明在大肠杆菌DH5α中表达了融合蛋白.Western blot证实,表达蛋白即为目的蛋白(图4).

图2 重组质粒pGEX-4T-1-TSHR的酶切鉴定及PCR鉴定

图3 重组蛋白表达的SDS-PAGE分析

图4 Western blot检测目的基因表达

3 讨论

本实验通过将PCR扩增得到的TSHR基因片段,连接到pGEX-4T-1,转化进大肠杆菌DH5α中,构建了青岛文昌鱼pGEX-4T-1-TSHR融合表达载体.重组质粒进行PCR、双酶切及测序检测,表明青岛文昌鱼TSHR基因准确插入pGEX-4T-1表达载体中.以时间为梯度,1mM IPTG诱导大肠杆菌的表达,发现4 h,5 h时表达量比较多.但是因为此蛋白是膜蛋白而且是激素类受体,所以总体来说表达量不是很大.用抗促甲状腺激素受体多克隆抗体进行Western blot检测,结果显示表达蛋白是TSHR蛋白.

促甲状腺激素受体在脊椎动物下丘脑—垂体—甲状腺调控轴中发挥着重要作用,被认为是甲状腺的一个特殊的蛋白.它的突变能引起一些重要的疾病,如甲状腺功能低下、甲状腺瘤、Graves眼病等.目前在脊椎动物中对其研究主要集中在疾病研究中.一些研究表明文昌鱼内柱和脊椎动物甲状腺具有同源性.

本实验成功表达了该蛋白,为后续研究该蛋白结构和生物功能,以及与其相互作用蛋白的研究奠定了基础,同时,鉴于文昌鱼的特殊进化地位,对于阐释TSH R蛋白的起源与进化,以及进一步探索其具体的分子机理都具有重要的理论和实践意义.

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