米诺环素对大鼠脑缺血再灌注损伤的脑保护作用

熊建忠, 陆兵勋

缺血性脑卒中的致死及致残率非常高,对于缺血性脑卒中目前缺乏有效的治疗方法。抗血小板治疗被认为是一种有效预防卒中的方法,对于急性缺血性脑卒中,静脉溶栓是目前唯一被证明有效的方法,但只能使部分患者获利[1]。最近的研究显示,脑梗死后的炎症反应对脑卒中的预后有很大的影响。米诺环素(Minocycline,MC)是半合成第二代四环素类抗生素,目前发现它除了具有抗菌作用之外,还具有很强的抗炎作用[2]。本研究将通过给脑缺血再灌大鼠腹腔注射米诺环素,了解米诺环素对缺血再灌注后环氧化酶 2(cyclooxygenase-2,COX-2)、前列腺素 E2(prostaglandin E2,PGE2)、细胞凋亡,脑缺血体积的影响。为米诺环素治疗缺血性脑血管病提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 动物分组 选择健康成年雄性 SD大鼠48只 (中南大学动物实验室提供),体重 (250～300g),随机分为 4组,每组 12只,即假手术组(术后30min,腹腔注射米诺环素 45mg/kg;生理盐水组(大鼠缺血后 30min,腹腔注射等量生理盐水);治疗组(大鼠缺血后 30min,腹腔注射米诺环素 45mg/kg);预处理组 (大鼠缺血前 12h腹腔注射米诺环素45mg/kg)。

1.2 模型的制备 采用改良的 ZeaLonga线栓法建立右侧大脑中动脉闭塞再通 (MCAO)模型,于缺血 1.5h后拨出线栓,形成脑缺血再灌注。假手术组(线栓插入深度为 10cm,不造成脑缺血)其余处理相同。

1.3 MRI检查 使用 GE 1.5T超导型磁共振成像系统,3英寸表面线圈,行冠状位 T2WI系列扫描。T2WI扫描参数(TR/TE/NEX4200/94/6)层厚 3mm,层间隔 0mm,FOV8cm×8cm,矩阵 256×256。利用体积分析软件测出病变体积(LV)及缺血侧半球体积(HVi),对侧半球体积(HVc)。校正后缺血病变体积比 =(HVc-HV i+LV)/HVc×100[3]。

1.4 COX-2免疫组织化学染色 大鼠缺血再灌注24h后,用 10%水合氯醛麻醉,等渗生理盐水和4%多聚甲醛 PBS液进行心脏灌注,断头取脑,取距嗅球尖端后 7～11mm间的脑组织块,置于 4%多聚甲醛中固定,脱水,包埋,连续切片,片厚 6μm。免疫组织化学染色严格按照说明书操作进行。染色成功后用高倍显微镜进行拍照,每张切片选取 5个视野,采用 Image-Pro Plus 6.0图像分析软件分析光密度值。

1.5 前列腺素 E2水平测定 大鼠麻醉后用等渗生理盐水快速灌洗,断头取患侧脑组织,分离额顶部皮质,置微型匀浆器中加 0.1ml无水乙醇研磨,再加等渗生理盐水 0.9ml充分研磨成匀浆,4℃离心3500r/min,15min,取匀浆上清液 200μl,按放免试剂盒说明操作,测出样品溶度。

1.6 Hoechst染色 切片常规脱腊透明后,置于 6孔板上以 0.9%生理盐水洗 3遍,每次 3min,吸尽液体,然后加入 0.5ml的 Hoechst染色液,手摇晃动以充分染色,染色 5min,完成后将切片置于载玻片上,滴上 1滴抗淬灭液,盖上洁净的盖玻片,在荧光显微镜下观察神经细胞凋亡形态。用荧光显微镜进行拍照,结果用 Image-Pro Plus 6.0计算各区域神经细胞凋亡的百分率。

1.7 统计学分析 全部数据采用 SPSS13.0统计分析软件进行分析,数据以±s)表示 ,数据之间采用单因素方差分析检测,P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

本实验结果显示,假手术组脑组织仅有少量凋亡细胞及少量 COX-2阳性细胞,PGE2在假手术组表达很低。生理盐水组细胞凋亡率,PGE2水平明显升高,COX-2强烈表达,与假手术组相比差别有统计学意义(P＜0.05),生理盐水组 T2WI检测可见缺血侧大片高信号强度区。米诺环素预处理组和治疗组与生理盐水组相比,细胞凋亡率、PGE2水平明显下降,脑缺血体积缩小,COX-2光密度降低差别有统计学意义(P＜0.05),结果(见表1、表2;见图1～图8)。

表1 各组大鼠脑缺血体积及细胞凋亡率(%)

表2 各组大鼠 COX-2光密度值及 PGE2水平

3 讨 论

缺血性脑血管病的致死、致残率非常高。目前是仅次于心脏病和癌症之后的第 3位致死原因。最近研究显示,脑梗死后的炎性反应对脑卒中的预后有很大的影响[4]。脑梗死后炎性因子包括环氧化酶2、前列腺素 E2、白细胞介素-1、肿瘤坏死因子等。COX-2、PGE2参与了脑缺血后脑损伤的发生、发展,并与脑缺血的预后关系密切。Kinoshita等研究显示,脑缺血 90min后或大脑中动脉永久闭塞,COX-2在半暗带和邻近皮质区表达强烈[5]。环氧化酶是催化花生四烯酸生成前列腺和血栓素的限速酶。COX-2为诱导型,在大多数组织中检测不到[6]。米诺环素是一种半合成的第 2代四环素衍生物 ,对革兰氏阳性及革兰氏阴性球菌等都有较好的抗菌作用[7]。最近研究表明米诺环素具有抗炎、抗凋亡、抗氧化等神经保护作用[8]。本组数据显示生理盐水组COX-2、PGE2的表达较假手术组明显增多,米诺环素组治疗组和预处理组能明显降低 COX-2、PGE2的表达。本试验结果与 Kim等结果相似[9]。目前认为米诺环素降低缺血后 COX-2,PGE2的表达,是通过抑制诱导型一氧化氮合酶 (iNOS)、减少一氧化氮的产生、抑制还原型辅酶Ⅱ氧化酶的活性、抑制P38促分裂原活化蛋白激酶(p38-MAPK)的磷酸化等途径,抑制小神经胶质细胞的激活与增殖而起作用的[10]。

脑缺血后神经元的死亡包括坏死和凋亡过程。在脑缺血急性期,神经元坏死和凋亡并存,细胞坏死位于缺血中心区,细胞凋亡主要出现在缺血半暗带区[11]。凋亡可能决定了最终梗死体积。本组数据显示,米诺环素预处理组和米诺环素治疗组、大鼠脑缺血的体积、凋亡细胞率较生理盐水组减少。米诺环素抗细胞凋亡作用与其对半胱氨酸蛋白酶Caspase-1和 Caspase-3的抑制[12],阻止细胞色素 C和促凋亡蛋白(Smac/DIABLO)的释放,上调抗凋亡因子 bcl-2等作用有关[13]。本实验结果进一步证实了米诺环素的抗凋亡作用。

本实验研究表明脑缺血再灌注后 COX-2、PGE2增加,细胞凋亡率增加,而米诺环素能明显减少 COX-2、PGE2的表达,及缺血半暗带的细胞凋亡率,对脑缺血再灌注损伤有脑保护作用。米诺环素是第 2代四环素类抗生素,多项研究表明其在脑缺血[14]、肌萎缩性 (脊髓 )侧索硬化[15]及帕金森病等疾病的发生过程中具有神经保护作用。然而,现今对于米诺环素的神经细胞保护作用的研究还处于动物实验阶段,其在临床上的神经保护作用有待进一步研究。

图1 假手术组

图2 生理盐水

图3 预处理组

图4 30min组

图5 假手术组

图6 生理盐水组

图7 预处理组

图8 30min

[1] Dyken PR.Neuroprogressive diseaseof post-infectiousorigin:areview of a resurging subacute sclerosing panencephalitis(SSPE)[J].Ment Retard Dev Disabil Res Rev,2001,7(3):217-225.

[2] Stirling DP,Koochesfahani KM,Steeves JD,et al.Minocycline as a neuroprotective agent[J].Neuroscientist,2005,11(4):308-322.

[3] Gerriets T,Stolz E,Walberer M,et al.Noninvasive quantification of brain edema and the space-occupying effect in rat stroke models using magnetic resonance imaging[J].Stroke,2004,35(2):566-571.

[4] Kim BJ,Kim MJ,Park JM,et al.Reduced neurogenesis after suppressed inflammation by minocycline in transient cerebral ischemia in rat[J].J Neurol Sci,2009,279(2):70-75.

[5] Kinoshita Y,Ueyama T,Senba E,et al.Expression of c-fos,heat shock protein 70,neurotrophins,and cyclooxygenase-2 mRNA in response to focal cerebral ischemia/reperfusion in rats and their modification by magnesium sulfate[J].J Neurotrauma,2001,18(4):435-445.

[6] Subbaramaiah K,Zakim D,Weksler BB,et al.Inhibition of cyclooxygenase:a novel approach to cancer prevention[J].Proc Soc Exp Biol Med,1997,216(2):201-210.

[7] Luccarini I,Ballerini C,Biagioli T,et al.Combined treatment with atorvastatin and minocycline suppresses severity of EAE[J].Exp Neurol,2008,211(1):214-226.

[8] Kikuchi K,Kawahara K,Biswas KK,et al.Minocycline attenuates both OGD-induced HMGB1 release and HMGB1-induced cell death in ischemic neuronal injury in PC12cells[J].Biochem Biophys Res Commun,2009,385(2):132-136.

[9] Kim SS,Kong PJ,Kim BS,et al.Inhibitory action of minocycline on lipopolysaccharide-induced release of nitric oxide and prostaglandin E2 in BV2 microglial cells[J].Arch Pharm Res,2004,27(3):314-318.

[10] Kremlev SG,Roberts RL,Palmer C.Differential expression of chemokines and chemokine receptors during microglial activation and inhibition[J].J Neuroimmunol,2004,149(1～2):1-9.

[11] Kiessling M,Gass P.Stimulus-transcription coupling in focal cerebral ischemia[J].Brain Pathol,1994,4(1):77-83.

[12] Scarabelli TM,Stephanou A,Pasini E,et al.Minocycline inhibits caspase activation and reactivation,increases the ratio of XIAP to smac/DIABLO,and reduces the mitochondrial leakage of cytochrome C and smac/DIABLO[J].J Am Coll Cardiol,2004,43(5):865-874.

[13] Suk K.Minocycline suppresses hypoxic activation of rodent microglia in culture[J].Neurosci Lett,2004,366(2):167-171.

[14] Wang CX,Yang T,Noor R,et al.Delayed minocycline but not delayed mild hypothermia protects against embolic stroke[J].BMC Neurol,2002,2:2.

[15] Kriz J,Nguyen MD,Julien JP.Minocycline slows disease progression in a mouse model of amyotrophic lateral sclerosis[J].Neurobiol Dis,2002,10(3):268-278.