β阻滞剂对急性期实验性脑出血大鼠的神经保护作用

王 岩, 闫丽儒, 纪 辉, 张纯慧, 李 丹, 董艳波

脑出血是一种高发病率和高死亡率的脑血管疾病,约 1/3患者伴有神经损伤,并直接影响患者预后,因而目前脑出血的治疗重点在于减轻出血周围脑组织损伤。神经细胞内钙超载被认为是引起细胞死亡及脑组织损伤的中心环节[1]。内皮素(Endothelin,ET)和降钙素基因相关肽(Calcitonin gene-related peptide,CGRP)是器官局部血流调节因子,ET具有强烈缩血管作用,也能对神经元和胶质细胞造成直接损害;而 CGRP是已知最强的扩血管物质之一[2,3],并有引起细胞内 Ca2+浓度下降的作用。正常情况下两者保持相对稳定,维持动态平衡,病理情况时两者平衡失控。有报道[4]表明脑出血患者的CGRP及 ET的动态变化规律与脑出血脑水肿病程变化及预后有关。因此,若能在脑出血早期抑制Ca2+内流并维持ET和 CGRP动态平衡,则受损的神经细胞可望得到恢复,这可能是今后治疗脑出血的一条可行途径。本实验拟在研究美托洛(β-阻滞剂)对大鼠实验性脑出血后神经细胞内钙离子浓度以及CGRP和 ET水平的影响,进而验证其对脑出血的脑保护作用。

1 材料与方法

1.1 实验材料 选择健康雄性成年 Wistar大鼠 84只,体重 200～230g,由哈尔滨医科大学实验动物中心提供。β-阻滞剂选用酒石酸美托洛尔片;CGRP、ET放免试剂盒由天津九鼎医学生物工程有限公司提供;肝素钠、30%水合氯醛、微量进样器、脑立体定位仪、低温离心机、微量注射器、手术器械由哈尔滨医科大学解剖学教研室提供。

1.2 实验方法

1.2.1 实验分组 Wistar大鼠 84只随机分为正常对照组(12只)、模型组(36只,24h、48h、72h各12只 )、药物治疗组(36只,24h、48h、72h各 12只)。

1.2.2 脑出血模型制备 模型组及药物治疗组大鼠称重后按 0.4mg/100g剂量给予水合氯醛腹腔麻醉,俯卧位固定于立体定位仪,鼠尾用 40℃水浴 10min,头皮下中切口约 1cm,于颅骨背侧前囟后0.2mm中线向左旁 2.9mm处钻孔,大鼠尾尖约 5cm断尾取血 40μl,固定于立体定位仪上并沿钻孔垂直进针,深约 6mm,缓缓注入鼠血,留针 1min后退针,缝合头皮。病理证实造模是否成功:按各组预定时间取尾状核部脑组织 2块,制备光、电镜标本。

1.2.3 给药方法 模型组造模后即刻给予0.9%生理盐水 1.5ml灌胃,药物治疗组造模后即刻给予美托洛尔100g/kg(溶于0.9%生理盐水1.5ml)灌胃。

1.2.4 血浆 ET及 CGRP测定 各组大鼠在相应观察点(造模后 24h、48h、72h)乙醚麻醉,摘除眼球取血约 3ml,置入含 10%EDTA二钠 30μl和抑肽酶 40μl的离心管内,低温 (4℃)高速离心,3000r/min,共 10min,取上清 -70℃冻存待测。CGRP及ET放免试剂盒购自天津九鼎医学生物工程有限公司,操作按试剂盒说明进行。

1.2.5 用 Fura-2/AM荧光探针法测定血肿周围神经细胞内 Ca2+浓度。

1.2.5.1 脑细胞分离 参考曹云鹏方法进行了改进。各组大鼠在相应观察点(造模后 24h、48h、72h)断头后剥离全脑,以冰冷的 D-Hanks液冲洗,去除小脑、脑干及部分白质并仔细剥离脑膜、血管(其中脑出血大鼠清除血肿),再次以 D-Hanks液冲洗 3次后剪碎,置于 20ml含 0.25%胰蛋白酶的 D-hanks液中,在 37℃条件下消化 15min后,以冰冷的含10%小牛血清的适量 Hanks液终止反应。组织块以吸管轻轻吹打后过 200目筛网,滤液以 1000rpm离心 5min,沉淀再次以 Hanks液冲洗 1次,最后将细胞悬浮于 37℃的 Hanks液中。台盼蓝除外试验检查,细胞存活率在 90%以上,将细胞数调整到 2×106个/ml。

1.2.5.2 Fura-2/AM负载 将上述细胞悬液1.5ml于 37℃下预温 5min后,加入用 DMSO配制的0.5mmol/L的 Fura-2/AM溶液(终浓度为 5μmol/L),37℃恒温振荡 45min,负载后的细胞以含 0.2%牛血清白蛋白的 Hanks液冲洗 2次,以 1000rpm离心 5min,最后沉淀用Hanks液悬浮,测前将细胞悬液37℃复温 5min。

1.2.5.3 荧光测定 采用日立 F-4500型双波长荧光分光光度计,发射光波长为 510nm,选定激发光波长为 340nm和 380nm,两狭缝均为 5nm。先测定静息下两波长的荧光值(F340、F380),两波长的最大荧光值由加入浓度为 10%的 TritonX-10020μl测得(Fmax340、Fmax380);最小荧光值由加入浓度为 100mmol/L的乙二醇双四乙酸(EGTA)80μl(pH＞8.5)获得 (Fmin340、Fmin380)。根据公式:[Ca2+]i=Kd(R-Rmin)Fmin380/(Rmax-R)Fmax380nmol/L,计算其中 Kd为 224nmol/L,R=F340/F380。

2 结 果

2.1 各组不同时间点血肿周围神经细胞内Ca2+浓度 正常组大鼠相应部位神经细胞内 Ca2+浓度为 216.2±29.8nmol/L。与正常对照组比较,模型组 24h后血肿周围神经细胞内 Ca2+浓度即显著增高(P＜0.01),且 72h内逐渐增加。与模型组比较,药物治疗组 24～72h各时间点血肿周围神经细胞内 Ca2+浓度均明显降低(P＜0.05),但均高于正常组(P＜0.01)(见表1)。

2.2 各组不同时间点血浆 ET、CGRP含量 正常组大鼠血浆 ET含量 98.46±45.47ng/L、CGRP含量为 44.33±6.90ng/L,ET/CGRP比值为 2.22。模型组血浆 CGRP含量高于正常组(P＜0.05),且 72h内逐渐增高;ET含量高于正常组(P＜0.05),以 48h升高最明显,之后有下降趋势。药物治疗组血浆 ET及 CGRP含量均高于正常组 (P＜0.05),且 72h内维持在一定水平;药物治疗组 24h ET与 CGRP含量高于模型组,CGRP含量增高有统计学意义(P＜0.05),而 ET含量增高无统计学意义 (P＞0.05);药物治疗组 48h、72h ET及 CGRP含量低于模型组(P＜0.05)(见表2)。

2.3 各组不同时间点 ET/CGRP比值 模型48h组比正常组 ET/CGRP比值增高明显 (P＜0.05),以 ET升高为主;药物治疗 24h组、48h组比正常组、模型组 ET/CGRP比值降低明显 (P＜0.05),均以 CGRP升高为主;其余各组与正常组ET/CGRP比值差别不明显(见表3)。

表1 各组不同时间点血肿周围神经细胞内Ca2+浓度变化(nmol/L)

表2 各组不同时间血清CGRP及ET水平变化(ng/L)

表3 各组不同时间点ET/CGRP比值

3 讨 论

Ca2+是细胞内重要的第二信使,是神经细胞发挥正常生理功能不可缺少的因素,主要参与细胞内外信息的传递、神经递质的合成与释放、酶的代谢与调节等。正常细胞中,细胞内外 Ca2+浓度差大致在1万倍,这种浓度差是保证细胞发挥生理功能的前提。细胞内钙离子不仅在正常的细胞功能中起重要作用,而且参与许多疾病的发生和发展过程。

既往研究已明确,Ca2+超载及其所触发的一系列有害代谢是导致神经细胞死亡的最后通路[1],细胞内 Ca2+超载在神经细胞凋亡的发生中起关键作用[5]。Ca2+超载不仅引起神经细胞蛋白质和磷脂代谢紊乱,导致严重的细胞毒性脑水肿,而且也是引起脑血管痉挛、血脑屏障通透性增加、从而使血管源性脑水肿加剧的重要因素。

因此,测定细胞内钙离子浓度对于了解正常细胞功能及与 Ca2+有关疾病的发生机制均有重要意义。ET是一种由 21个氨基酸组成的血管活性多肽,是血管内皮细胞分泌的一种强有力的血管收缩因子,通过激活钙通道、增加钙离子内流、促进血管平滑肌细胞收缩[2],进而引起血管收缩。

CGRP是体内最强的舒血管生物活性多肽,为内源性血管舒张物质。ET与 CGRP二者广泛分布于中枢神经系统和心血管系统中[3]。正常情况下,CGRP与 ET之间处于动态平衡状态维持脑血管的舒缩功能,CGRP对 ET的生物效应能产生拮抗作用、能抑制病理条件下 ET的大量释放[6]。CGRP还可以抑制脂质过氧化的发生,扩张血管,提高脑血流量,有利于侧支循环的开放,减轻缺血缺氧和脑组织损伤的作用,并有引起细胞内 Ca2+浓度下降的作用。

有文献报道[4],脑出血急性期血浆 CGRP及 ET水平高于对照组,以 ET升高尤为显著。

研究认为血浆 ET含量增高原因可能与脑组织缺血、缺氧、应激、内皮细胞损伤及局部凝血酶增加等诸多因素有关,这些因素导致 ET的基因表达增强,从而增加 ET释放。而脑出血时 CGRP水平增高可能是一种代偿机制,CGRP既参与脑损伤的发生发展过程,也在机体病理条件下有防御和代偿作用,与ET在一定范围内保持平衡[7]。

本实验结果表明,大鼠实验性脑出血急性期血肿周围钙离子浓度明显高于正常组,且 3d内逐渐增高;血浆中 ET含量亦高于正常组,以第 2天升高最明显,第 3天血浆 ET含量有所下降,但仍高于正常;血浆中 CGRP含量高于正常组,其变化规律与血浆ET含量变化规律基本一致,但以 ET升高尤为显著。此结果与文献报道[8,9]相符,且与临床上脑出血病情多在 2～3d内恶化相一致,支持脑出血时钙离子浓度、CGRP与 ET的动态变化规律与脑出血、脑水肿病程变化及预后有关。神经细胞内钙超载被认为是引起细胞死亡及脑组织损伤的中心环节,ET可能是脑出血发生、发展及恶化的重要因素[10],而 CGRP在脑出血急性期可代偿性增高,拮抗 ET作用,抑制钙离子内流,发挥其内源性保护作用。

本实验表明:在 β-阻滞剂作用下,钙离子浓度明显下降,从而减轻因细胞内钙超载引起的神经细胞死亡及脑组织损伤;而 ET及 CGRP均有升高,但低于模型组,以 ET降低尤为明显,ET水平高于正常,但稳定在一定水平不持续上升,并且与 CGRP水平相适应,ET/CGRP比值更加接近(略低于)正常,并在一定范围内保持平衡,在这种平衡之中 CGRP略占上风,从而减轻了 ET为主的脑组织损害,为CGRP脑保护作用的发挥创造条件。

本实验仅研究了美托洛尔(β-阻滞剂)对大鼠脑出血后神经损伤的保护作用,并对其作用机制作了简单探讨,认为其神经保护作用可能与抑制钙超载、调控血浆 ET和 CGRP含量有关。神经细胞内钙超载及 ET与 CGRP的动态平衡破坏均参与了脑出血后继发性脑组织的损伤,且各因素间相互联系,互为因果,具体机制尚待进一步探讨。

β-阻滞剂在临床上主要用于高血压病的治疗,而临床上脑出血早期不主张使血压降得过低,以免造成脑灌注压不足,加重脑乏氧,进而加重脑损伤。然而 β-阻滞剂降压作用缓慢且较温和,一般连服 1w方达最高疗效。而且 β-阻滞剂作用结果是使心律减慢、心输出量减少、总外周阻力有所降低,血压不变或略降,但是脑组织血流量并不下降,而是其他组织血流下降。所以 β-阻滞剂并非脑出血治疗的绝对禁忌。

本研究可能为脑出血的辅助治疗提供新的有效途径。

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