内蒙古包头地区单核细胞趋化因子 MCP-1 2518G/A基因多态性与脑梗死的相关性研究

杨月仙, 张茂林, 刘 波

脑梗死(CI)是中老年人常见的多发病,其病残率与死亡率很高。脑梗死的发病是由环境和遗传因素共同起着作用。研究[1～3]发现,单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)基因调控区序列多态性位点-2518G/A可能与 MCP-1转录活性有关,而且与动脉粥样硬化、冠心病等的发病有关。目前文献研究较多的是糖尿病、系统性红斑狼疮、硬皮病、冠心病与基因多态的关系。但它和缺血性脑血管病的关系的临床研究较少,特别是和脑梗死病情轻重的关系尚未见临床研究报道。本研究应用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性方法检测脑梗死患者和健康人的MCP-1基因-2518G/A多态性,分析并探讨急性脑梗死与 MCP-1多态性之间的关系,

1 资料与方法

1.1 临床资料 (1)脑梗死组:2009年 6月 ～2010年 1月包头医学院第一附属医院神经内科住院的急性脑梗死患者 148例,病程 ＜3d;均符合全国第四届脑血管病学术会议修订的诊断标准[4],并经头部 CT/MRI证实。排除标准:合并脑出血、恶性肿瘤患者;近 1个月内有感染史、近 3个月内有心肌梗死或心绞痛病史,合并慢性炎性反应(关节炎、血管炎、胆囊炎)患者;风湿病、系统性红斑狼疮、多发性硬化等免疫性疾病患者;肝肾功能不全患者。其中男 82例,女 66例,年龄 42～75(60.97 ±7.7)岁。(2)正常对照组:选取 130名在包头医学院第一附属医院体检中心进行体检的年龄、性别相匹配的无脑梗死的体检者。排除标准同脑梗死组。男 60例,女70例,年龄 39～72(59.3±7.42)岁。

1.2 检测方法

1.2.1 基因组 DNA样品制备 抽取入组者外周静脉血 5ml枸橼酸钠抗凝,-20℃保存至提取基因组 DNA,应用常规苯酚-氯仿方法抽提基因组DNA。

1.2.2 MCP-1-2518G/A基因多态性分析 引物序列[1]由大连宝生物有限公司合成,具体序列如下:上游引物 5'-CCGAGATGTTCCCAGCACAG-3',下游引物 5'-CTGCTTTGCTTGTGCCTCTT-3'。PCR反应体系采用试剂盒配制法,具体如下:10×buffer 50μl,dNTP 10μl(浓度为 10μmol/l),正负引物各4μl(1 OD溶于 200μl H2O),H2O 332μl(合计400μl),混匀后分管,每管 10μl,加液体石蜡12.5μl,Taq酶 0.6μl(2U/μl),每管加基因组 DNA 2μl。反应条件:93.5℃预变性 3min,94℃变性 35s,55℃退火 45s,72℃延伸 5min,共 30循环,继后 72℃终末延伸 5min。PCR扩增目的条带为 930bp。取 PCR扩增产物 10μl加限制性内切酶 PvuII 1μl及相应缓冲液,用蒸馏水补齐至 20μl,混均后离心 30s。放入37℃水浴箱中孵育 12h使样品完全酶切。2%琼脂糖凝胶电泳,以 100bp Marker为相对分子质量标记,于紫外灯下观察结果并拍照记录(见图1)。其中GG基因型可见两条电泳带为 708bp、222bp;GA基因型电泳带为 930bp、708bp、222bp;AA基因型电泳带为 930bp。

1.3 统计学方法 采用 SPSS13.0软件包进行数据处理。采用直接计数法计算 MCP-1基因-2518G/A等位基因频率。由于每个患者 MCP-1基因-2518G/A位点均有两个等位基因,故等位基因频率 =等位基因阳性数 /总基因数(患者数 χ2)。计数资料以率(%)表示,采用 χ2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 脑梗死与对照组基因型及等位基因频率分布 脑梗死组患者 148例,其中 GG基因型 52例,GA基因型为 68例,AA基因型 28例。脑梗死组MCP-1基因-2518G/A基因型 GG、G等位基因频率均高于对照组(P＜0.05)(见表1)。

2.2 病情与 MCP-1-2518G/A基因型及等位基因频率发布 病情重度的患者 MCP-1基因-2518G/A,GG基因型及 G等位基因频率均明显高于病情轻度的患者,P＜0.05。病情轻度与中度及中度与重度之间差异无统计学意义(P＞0.05)(见表2)。

表1 MCP-1基因-2518G/A基因型分布及等位基因频率(例,%)

表2 病情与MCP-1基因多态性分布及等位基因频率的关系(例,%)

图1 MCP-1基因-2518位点 PVuII酶切图(MMarker;1 GG;6 AA;2,3,4,5均为 GA)

3 讨 论

近年的研究表明多种免疫细胞及细胞因子参与了脑梗死的发生、发展及修复过程。MCP-1是趋化因子 CC类亚家族成员之一,以簇聚方式定位于人17号染色体和小鼠 11号染色体,对白细胞、T淋巴细胞、嗜碱性细胞、自然杀伤细胞和造血祖细胞均有趋化作用。正常脑组织不表达 MCP-1,当中枢神经系统受到损害刺激(包括感染、创伤、卒中以及免疫调节障碍等)时,小胶质细胞和星形胶质细胞活化,前者在 MCP-1作用下迅速增殖并向受损部位迁移,吞噬坏死组织而变为吞噬细胞。MCP-1基因表达主要在转录水平的 2个区域内受到调控:(1)近端调控区:主要由血小板源性生长因子 (platelet-derived growth factor,PDGF)和干扰素(interferon,IFN)-γ诱导表达;(2)远端调控区:可与核因子-κB(nuclear factor-κB,NF-κB)结合,调节肿瘤坏死因子 (tumo rnecrosis factor,TNF)诱导的 MCP-1表达[5]。1999年 Rovin[1]等通过直接测序 PCR扩增的基因组 DNA发现在 MCP-1的远端调控区有 2个新的多态性位点。这个双基因多态性在重要的转录起始位点相关基因-2518(G/A)和-2076(A/T)位点上。在-2076位点的基因多态性不影响 MCP-1的转录。同时发现MCP-1基因启动子区第 2518位核苷酸存在 A-G碱基突变,存在 3种基因型:野生型纯合子 AA、杂合子AG和突变型纯合子 GG,构成了 MCP-1基因启动子区-2518A/G单核苷酸多态性。在-2518 G位点的杂合子或纯合子的个体与在-2518 A位点的纯合子的个体相比较,用 IL-1β处理外周血单核细胞,前者产生更多的 MCP-1;说明 MCP-1的远端调控区的多态性通过炎症刺激的应答而影响 MCP-1表达。

既往亦有研究[1,6]报道,冠心病患者具有较高的G等位基因携带频率。我们推测,MCP-1基因-2518G/A多态性与动脉粥样硬化、冠心病、脑梗死等这些缺血性血管疾病的发病存在一定相关性。本研究结果显示:脑梗死组 MCP-1基因-2518G/A位点 G等位基因频率明显高于对照组(χ2=5.636,P=0.018)。提示 G等位基因可能是脑梗死发病的遗传易感基因。

文献报道[7],急性脑梗死患者中、重度组的MCP-1水平明显高于轻度组,MCP-1的水平与脑梗死的严重程度成正相关。本研究中,脑梗死患者轻、中、重之间 MCP-1基因-2518G/A位点 G等位基因频率存在差异(χ2=7.062,P=0.029)。重度组的MCP-1基因-2518G/A位点 G等位基因频率明显高于轻度组(χ2=6.059,P=0.014),差异显著。推测MCP-1基因-2518G/A多态是通过调节 MCP-1基因的转录、翻译表达,进而影响脑梗死的发生、发展;MCP-1基因-2518G/G基因型可上调 MCP-1的表达,增加单核细胞的聚集,从而增加动脉粥样硬化损害及脑梗死发病的危险性。

MCP-1作为一种主要的单核细胞趋化因子,在中枢神经系统疾病中起双重作用。一方面,MCP-可诱导单核巨噬细胞到达受损部位参与组织修复,是机体防御的重要组成部分;另一方面,组织局部产生的大量 MCP-1又可引起过度的炎症反应,从而加重组织损伤。随着对 MCP-1的分子结构、生物学功能、基因定位和调节信号转导机制的进一步认识,以及它对其他细胞因子和炎症细胞调控的深入研究,探索干预某些环节的可能性,研制相应抗体和药物,将有可能为中枢神经系统疾病的治疗和干预提供一条新的思路。

[1] Rovin BH,Lu L,Saxena R.A novel polymorphism in the MCP-1gene regulatory region that influences MCP-1expression[J].Biochem Biophys Res Commun,1999,259:344-348.

[2] Tabara Y,Kohara K,Yamamoto Y,et al.Polymorphism of the monocyte chemoattractant protein(MCP-1)gene is associated with the plasma level of MCP-1 but not with carotid intima-media thickness[J].Hypertens Res,2003,26:677-683.

[3] McDermott DH,Yang Q,Kathiresan S,et al.CCL2 polymorphisms are associated with serum monocyte chemoattractant protein-1 levels and myocardial infarction in the Framingham Heart Study[J].Circulation,2005,112(8):1113-1120.

[4] 中华神经科学会,中华神经外科学会.各类脑血管疾病诊断要点[J].中华神经科杂志,1996,29(6):379-380.

[5] 许 莉,张祥建.单核细胞趋化因子-1与中枢神经系统疾病[J].国外医学脑血管疾病分册,2005,13(8):626-627.

[6] Jemaa R,Rojbani H,Kallel A,et al.Association between the-2518G/A polymorphism in the monocyte chemoattractant protein-1(MCP-1)gene and myocardial infarction in Tunisian patients[J].Clin Chim Acta,2008,390(1～2):122-125.

[7] 王其春,李运刚.急性脑梗死患者血浆单核细胞趋化蛋白-1和组织因子水平的变化[J].中国误诊学杂志,2008,8(31):7564-7565.