运动神经元病患者骨骼肌纤维再生病理研究

赵清石, 江新梅, 鞠 浩, 马玉刚

运动神经元病(motor neuron disease,MND)包括肌萎缩侧索硬化症(amyotrophic lateral sclerosis,ALS)、原发性侧索硬化症(primary lateral sclerosis,PLS)和脊肌萎缩症(spinal muscular atrophy,SMA)等,是选择性的侵犯运动系统,导致运动神经元变性,表现为进行性肌无力和肌萎缩,目前尚无有效治疗方法[1]。有研究发现炎性肌病及进行性肌营养不良患者骨骼肌内存在活跃的肌纤维再生,肌卫星细胞位于肌膜和基底膜之间的单核细胞,在普通光镜下观察,很难与肌膜核区别开,通过电子显微镜可以识别肌卫星细胞,肌卫星细胞在再生过程中起重要作用,其活化、增殖、分化可以修复受损肌纤维,从而引起再生[2]。但在运动神经元病中对肌纤维再生的研究甚少,因此促进运动神经元病患者肌纤维再生,及再生肌纤维的增生、肥大可能成为治疗该病的一种方法,因此本实验重点研究运动神经元病肌纤维再生特点,为治疗该病奠定理论基础。

1 资料与方法

1.1 临床资料 收集运动神经元病患者肌活检骨骼肌标本,取少量骨骼肌留做电镜研究,其中包括肌萎缩侧索硬化症 4例,脊肌萎缩症 2例,肌病理象大致正常标本 1例作为对照。所有肌病诊断均确立在临床、辅助检查、病理诊断基础之上[3]。所有患者均签属手术同意书。

1.2 试剂与仪器

1.2.1 试剂 Tissue-TEK,3%戊二醛,1%锇酸,乙醇,Epon 812环氧树脂,醋酸双氧铀,柠檬酸铅。鼠抗人神经细胞黏附分子(NCAM)单克隆抗体(1∶50,美国 Santa Cruz Biotechnology公司产品);动物血清(马血清,中美合资兰州民生海洋生物有限公司);ABC试剂盒(美国 Vector Laboratories公司产品)等。

1.2.2 仪器 JEM-1200EX型透射电子显微镜(日本),尼康光学显微镜(日本),LKB-Ⅲ超薄切片机 (瑞士 )等 。

1.3 方法

1.3.1 组化染色 HE染色。

1.3.2 免疫组织化学染色分析 冰冻切片丙酮固定(-20℃,10min),4℃ 0.01mol磷酸盐缓冲液(phosphate buffer sodium,PBS)(5min,3次);4℃0.3%H2O2/甲醇(30min),PBS(5min,3次 );10%马血清封闭(30min),1%小牛血清白蛋白/磷酸盐缓冲液(1%albumin bovine/PBS,BSA)1∶10稀释抗-NCAM单克隆抗体(Santa Cruz,America),4℃过夜,PBS(5min,3次);1%BSA 1∶200稀释抗鼠 IgG抗体(CBS,Japan)作为二次抗体,室温 30min,PBS(5min,3次);ABC(avidin-biotin-peroxidase complex,VECTASTAIN Standard ABC kit)发色反应,室温30min,PBS(5min,3次);0.3%3-3'-二氨基联苯胺(3-3'-diaminobenzidine tetrahydrochloride,DAB/0.05 mol Tris-HCL染色,1%H2O21～1.5ml;室温 5～10min,PBS终止反应,流水洗 5min;轻度核染 30～60s,流水洗 10min;依次酒精脱水(75%、85%'95%‘100%),二甲苯透明两次,加拿大香胶封片。

1.3.3 电子显微镜标本制作及病理分析 肌肉标本切成 1mm3,3%戊二醛中固定,继之以 1%锇酸固定,系列丙酮脱水、浸透,Epon812环氧树脂包埋,半薄切片定位分析后,制备超薄切片,醋酸铀-枸橼酸铅电子双染色,JEM-1200EX型透射电子显微镜观察、摄片,进行病理分析。

2 结 果

2.1 神经源性改变患者骨骼肌标本组化染色特点和超微结构特点

2.1.1 神经源性改变 HE染色特点 HE染色片中肌萎缩与肥大纤维并存,萎缩肌纤维呈圆型、角型,簇状分布,其间有相对肥大肌纤维,肌核轻度增加,肌间质无异常,可见群萎缩(见图1)。

2.1.2 抗-NCAM单克隆抗体染色 NCAM作为判断再生肌纤维的标记物,ALS未见肌纤维NCAM染色着色(见图2);SMA仅见部分小直径肌纤维 NCAM染色着色(见图3)。

2.1.3 神经源性改变肌肉标本的超微结构特点 电子显微镜下,肌纤维的横纹保存相对良好,肌原纤维萎缩,可见静止肌卫星细胞,存在于肌细胞膜和基底膜之间,胞体成分少,缺乏细胞器。可见活化的肌卫星细胞,胞体增大,可见肌丝样结构(见图4)。可见分裂的肌卫星细胞,胞体增大,染色质分为两部分(见图5)。

2.2 大致正常骨骼肌标本组化和超微结构特点HE染色光镜下观察见肌纤维大小基本正常,肌核无增加,肌间质正常。电子显微镜下观察见有规则的横纹结构,未见活化的肌卫星细胞及再生肌纤维。

图1 HE染色×200

图2 抗-NCAM染色 ×200

图3 抗-NCAM染色 ×200

图4 活化肌卫星细胞 TEM×5000

图5 分裂中的肌卫星细胞 TEM×8000

3 讨 论

骨骼肌纤维再生的过程中,肌卫星细胞活化、增殖和融合起至关重要的作用[4]。肌卫星细胞在健康人体内一般处于休眠状态,在某些肌病(如进行性肌营养不良和炎性肌病等)状态下及某些因素作用下被激活,肌卫星细胞的胞体变大,细胞器核膜表面的空泡增加,称为活化的肌卫星细胞,又称为成肌细胞。由正常的休眠状态转变为活化状态,经分裂、增殖、迁移、融合等过程形成新的肌纤维,在接受神经支配、血运重建等局部微环境调节下,形成新的再生肌纤维,新形成的肌纤维肥大、增粗,最终形成成熟的肌纤维,去修复损伤的肌纤维,以补充肌病状态造成的肌纤维损失[5]。

卫星细胞的激活不被限制在损伤部位。实际上,一个肌纤维末端的损伤将要沿着这个肌纤维激活卫星细胞,从而导致卫星细胞增殖和迁移到再生的部位。增殖后,部分肌卫星细胞转为休眠状态,被储存于基底膜下,为后来的肌纤维再生所用[6]。肌卫星细胞在发育过程中的肌肉内以及伴有坏死和再生的病理性肌肉内(如肌营养不良)数量明显增加。是存在于肌细胞膜和基底膜之间的单核细胞,普通光镜下无法将其与肌核分辨开,需要电镜下观察[7]。

我们研究的几例神经源性改变的肌病,在电子显微镜下均看到有肌卫星细胞的活化、分裂,说明存在肌纤维的再生的早期活动。实验观察到 ALS患者骨骼肌抗-NCAM染色未见到再生肌纤维,而通过电镜下观察可见静止期卫星细胞,包括肌卫星细胞的活化、分裂等,再生处于早期阶段,没有见到融合成较成熟的再生肌纤维,确实存在吞噬细胞吞噬肌纤维的过程,但是巨噬细胞少见,炎性反应不活跃,较肌营养不良患者的电镜下表现相差很多,因此考虑该病再生机制并非与炎症介导相关。实验发现 SMA患者骨骼肌在抗-NCAM染色下可见有少量的小径再生肌纤维,未见发育成熟的再生肌纤维,临床上此类患者的肌酸激酶(CK)正常或轻度增高,病理像中可见该病伴有轻微炎性反应,因此推断可能该病炎性反应参与并介导肌纤维再生,与 ALS再生机制存在差别,机体机制有待于进一步研究。

有研究表明骨骼肌再生主要取决于 3个方面[8,9]:基底膜的完整;受损肌肉的血供重建;受损肌肉的神经支配。此类肌病患者肌纤维神经源性改变主要由于失神经支配而出现萎缩,因此虽然运动神经元病患者肌肉内存在肌卫星细胞的活化、分裂及早期再生肌纤维,具有再生能力,存在早期再生,但是未见再生肌纤维发育成熟,不能形成正常肌纤维。因此找到促进运动神经元病患者肌纤维再生、成熟的方法可能是治疗该病的另一途径,有待于进一步深入研究。

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