GRIN2B近似启动子区多态性与散发性阿尔茨海默病相关性分析

江汉秋, 张晓君, 刘 瑾, 马中华, 贾建平

阿尔茨海默病(Alzheimer's disease,AD)是一种以记忆力明显下降为主要表现的进行性神经系统变性疾病。大脑皮质及海马的突触减少被认为是 AD早期认知损害的主要原因[1,2]。N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartate,NMDA)受体是位于突触后膜的离子型谷氨酸受体的一个亚型。在生理条件下,NMDA受体通过与谷氨酸结合,使 Ca2+通道开放,从而促进突触的传递、诱发长时程增强,而这些都与学习和记忆非常相关[3]。

近年来有研究发现,AD脑内在一些敏感区域的NMDA受体亚基转录及蛋白水平下降,尤其是 N-甲基-D-天冬氨酸受体 2B(N-methyl-D-aspartate receptor 2B,NR2B)水平下降尤为突出[4,5]。本课题组在之前的研究中已经筛查了中国北方汉族人群GRIN2B基因近似启动子区(-1621bp至 +177bp)的变异位点,并发现-421C/A多态性与AD发病有明显的相关性。故本研究继续研究启动子区(-2454bp至-1269bp)多态性,进一步从遗传学角度阐述其与SAD发病的关系。

1 材料和方法

1.1 研究对象 共 362例散发性阿尔茨海默病(sporadic Alzheimer's disease,SAD)患者,男 165例,女 197例,平均年龄 70.4±6.8岁。均为 2000年 ～2007年来自首都医科大学宣武医院、北京市老年病医院、北京市 10余家老人院的患者。所有患者均进行简易精神状态量表(Mini-Mental State Examination,MMSE)评分和 Hachinski缺血评分。采用美国国立神经病、语言机能紊乱和卒中研究所及阿尔茨海默病和相关疾病协会(the National Institute of Neurological and Communicative Disorders and Stroke and the Alzheimer's Disease and Related Disorders Association,NINCDS-ADRDA)临床诊断标准,把诊断为“很可能 AD”的患者列为研究对象。对照组共 334例健康老年人,男 142例,女 192例,平均年龄 68.4±8.1岁。均为 2000年 ～2007年间宣武医院门诊及秦皇岛海港区退休人员体检者,且均经 MMSE评分、Hachinski缺血评分和门诊系统体检证实为健康人。

1.2 基因组 DNA提取 全部研究对象采集清晨空腹外周静脉血 5ml,构椽酸钠抗凝,常规酚-氯仿抽提法提取基因组 DNA。

1.3 GRIN2B启动子区变异位点筛查

1.3.1 引物设计 根据 NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/mapview/)及 Miyatake等研究[6]中提供的资料,在 GRIN2B近似启动子区用 Primer Premier 5设计引物(见表1)。

1.3.2 PCR扩增 随机选取 25例 SAD患者和 25名正常对照者的 DNA标本,用标准 PCR方法扩增 GRIN2B基因近似启动子区,其位于相对转录起始点(transcription start site,TSS)-2454bp至-1269bp区域。PCR反应体系:DDH2O 9.6μl,2×缓冲液 12.5μl,dNTP(10mmol)0.8μl,上 、下游引物(10pmol/μl)各 0.5μl,LA Taq酶 (5U/μl)0.1μl,DNA模板 1.0μl。反应条件:94℃预变性 5min,94℃30s,65℃30s,72℃1min 50s,共 30个循环,72℃再延伸7min。

1.3.3 直接测序 用直接测序的方法系统筛查 GRIN2B启动子区变异位点(共 1186bp)。

1.4 多态性分型

1.4.1 引物设计 用 Primer Premier 5设计引物,分别扩增各相应片段(见表1)。

1.4.2 PCR扩增 对所有样本均进行相应片段的 PCR扩增。PCR反应体系均为:DDH2O 10.0 μl,2 ×缓冲液 12.5μl,dNTP(10mmol)0.4μl,上、下游引物 (10pmol/μl)各 0.5μl,LA Taq酶 (5U/μl)0.1μl,DNA模板 1.0μl。反应条件:94℃预变性5min,94℃30s,55℃30s(-1887 A/G和-2315 A/G位点均为 54℃),72℃30s,共 35个循环,72℃再延伸5min。

1.4.3 限制性内切酶消化和电泳(见表2)。

1.5 统计学处理 通过 SHEsis检测每组各多态性的分布是否符合 Hardy-Weinberg(HW)平衡(http://analysis.bio-x.cn/myAnalysis.php)[7]。等位基因和基因型频率在患者和对照组中的分布差别均用 SPSS 16.0统计软件包进行卡方检验。与疾病的关联强度用比值比(Odds Ratio,OR)和 95%可信区间(95%confidence intervals,95%CI)表示。用Logistic回归校正年龄、性别和 APOE状态。P＜0.05被认为有统计学差异。

2 结 果

2.1 GRIN2B近似启动子区变异位点筛查 我们对随机选取的 25名 SAD患者和 25名正常对照者的 GRIN2B近似启动子区-2454bp至-1269bp片段进行直接测序发现存在4个多态性位点,除之前发现的-1447T/C(ENS10557853)和-1497G/A(rs12368476)外[8],还 有-1887A/G(rs10845866)和-2315A/G(rs10845867)两个多态性位点。

2.2 GRIN2B近似启动子区-1887A/G、-2315A/G多态性位点的遗传学分析。

2.2.1 分型依据(见表3)。

2.2.2 遗传学统计分析 每个多态性位点在人群中的基因型和等位基因分布均符合 HW平衡。-1887A/G和-2315A/G多态性位点的基因型频率和等位基因频率在 SAD和正常对照组中均无显著性差异,其中基因型分布 P=0.841和 P=0.298,等位基因频率 P=0.605和 P=0.409。在不携带APOEε4的人群中,-1887A/G和-2315A/G多态性位点的基因型频率和等位基因频率在SAD和正常对照组同样无显著性差异,其中基因型分布 P=0.733和 P=0.665,等位基因频率 P=0.738和 P=0.686;在携带 APOEε4的人群中,他们的分布仍然没有不同。此外,我们通过 Logistic回归(见表4),并没有发现这两个多态性位点的 AA基因型可增加或减少 AD的发病。

表1 GRIN2B近似启动子区多态性筛查所需引物及PCR产物片段长度

表2 GRIN2B启动子区多态性限制性内切酶消化片段长度及电泳条件

表 31887和-2315多态性位点基因型及等位基因在AD与正常人中的分布及比较

表 41887和-2315多态性与AD疾病危险度的相关分析

3 讨 论

目前,基因多态性与 AD发病相关联的观点已逐步被接受。最近的一些研究焦点已不仅仅集中在基因的外显子或者内含子上,而且也包括了基因的其它调控区。越来越多的研究显示,某些基因的启动子区多态性可能与 SAD的发病风险有关。关于GRIN2B基因与 AD少有研究,Tsai等[9]研究了NR2B亚基 2664T/C多态性与 AD的关系,但其检测的 132例 AD患者基因型及等位基因频率与 114例正常人没有显著差异,该变异可能属于沉默变异,并没有改变氨基酸序列。最近,Seripa等人[10]对高加索人 222例 AD患者和 170正常健康人的研究中,发现 GRIN2B启动子区的-200T/G位点、第 13外显子的 2664T/C位点和 3'UTR的 5073G/T位点的基因型及等位基因频率与 AD的发病无关,然而通过单体型分析发现-200G2664C5073T单体型可增加 AD的发病风险。

本课题组之前的研究已经发现了中国北方汉族人群中 GRIN2B启动子区存在-200T/G(rs1019385)、-421C/A(rs3764028)、-1447T/C(ENS10557853)和-1497G/A(rs12368476)多态性位点,其中-421C/A多态性与 AD的发病有明显的相关性。为此,本研究继续探讨了 GRIN2B近似启动子区其他多态性位点与 AD的发病关系。然而,所发现的-1887A/G和-2315A/G多态性位点无论是基因型还是等位基因频率均和 AD的发病无关。在APOEε4分层中,无论是否携带 APOEε4,其基因型及等位基因频率仍然与 AD的发病无明显相关。

国内外学者关于 GRIN2B启动子区变异与疾病(如:精神分裂症、亨廷顿舞蹈病、酒精中毒等)相关性的研究除本研究之前发现的-421C/A多态性与AD发病有关外,其他主要集中在-200T/G位点上[11～13]。到目前为 止,只有 Seripa等人[10]对GRIN2B启动子区多态性位点与 SAD的发病关系进行了研究,且只研究了-200T/G这一个启动子区多态性位点,结果表明在高加索人群中,该多态性位点与 SAD的发病不相关,但与其他位点的单体型可能与 AD发病有关。本研究进一步的启动子上游碱基多态性位点的筛查中,也未发现与 AD相关的其他多态性位点。为此,我们认为在今后的研究工作中进一步扩大样本量或者另外去探寻中国北方汉族人群编码区或 3'UTR的多态性位点,才有可能发现有意义的单体型,从而明确 GRIN2B基因变异在 SAD发病中的作用。

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