刘旭华,朱明慧,郭 凯
(郑州人民医院,河南郑州 450003)
亚临床动脉粥样硬化患者血液环氧合酶-2水平研究
刘旭华,朱明慧,郭 凯
(郑州人民医院,河南郑州 450003)
目的:探讨亚临床动脉粥样硬化(AS)患者血浆中环氧合酶Ⅱ(COX-2)的活性和单个核细胞COX-2mRNA的表达水平。方法:分别应用酶联免疫法和逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测100例亚临床AS患者和40例健康对照血浆COX-2活性与单个核细胞COX-2mRNA表达,并结合临床资料进行分析。结果:亚临床AS组COX-2血浆活性水平[(10.84±3.11)U/L]明显高于正常对照组[(6.97±1.25)U/L],差异有统计学意义(P<0.05);RT-PCR半定量分析发现亚临床AS组血液中单个核细胞COX-2mRNA表达的平均吸光度(0.244 8±0.090 3)较正常对照组(0.005 8±0.002 7)显著升高(P<0.01)。结论:COX-2血浆活性水平和COX-2mRNA的表达水平与亚临床AS有明显相关性,检测血浆COX-2活性和COX-2mRNA的表达可作为亚临床AS监测的参考指标。
动脉粥样硬化;环氧合酶Ⅱ;亚临床
亚临床动脉粥样硬化(AS)是指有AS的易患因素,而无AS临床表现的疾病发展阶段。资料显示[1]:该阶段动脉内存在活跃的低度慢性炎症,动脉内的轻微炎症是一个引发刺激、损伤、愈合的反复过程,最终形成斑块,其结果导致动脉狭窄或粥样斑块。环氧合酶Ⅱ(COX-2)是动脉粥样硬化过程中重要的炎症介质之一。RT-PCR分析表明COX-2在血管平滑肌、单核细胞、成纤维细胞均有表达,COX-2的过度表达可造成血管壁的炎症、斑块的不稳定和内膜增生。许多病理研究表明,COX-2直接参与了AS病理发生及斑快炎性反应的调控过程。笔者采用外周血测定COX-2水平和COX-2mRNA的表达,方便简捷,能为临床诊治提供参考。现报道如下:
1.1.1 亚临床AS组 选取100例患者,其中,男62例,女38例,年龄27~82岁,平均(54.0±12.8)岁。其均为有高血压、高血脂、长期抽烟史、糖尿病或肥胖等至少一项以上AS的易患因素但无症状的亚临床AS疾病患者,或有酗酒史、心理或社会压力大者,且超声检测颈动脉 IMT>1.0 mm或发现斑块且无心脑肾及外周血管病变的临床表现[2]。
1.1.2 健康对照组 正常对照组来自体检健康人群,共40例,其中,男 25 例,女 15 例,年龄 32~81 岁,平均(54.5±12.3)岁,无高血压、糖尿病及心、肺、肝、肾、脑和血液系统的疾病,无近期外伤手术史。全部入选对象均排除有急慢性感染、肿瘤、免疫性及变态反应性疾病。
1.1.3 标本采集 收集静脉血5 ml EDTA抗凝,3 000 r/min离心5 min,分离血浆;淋巴细胞分离液1 500 r/min离心15 min分离单个核细胞。分别于-70℃冻存备用。
COX-2活性试剂盒由西班牙Cayma公司提供。ELX 800NB酶标仪由美国BIO-TEK公司生产。核酸分析仪DU800由美国贝克曼公司生产,核酸扩增仪PE9700由美国ABI公司生产,Trizol试剂由美国Invitrogen公司生产,淋巴细胞分离液由中国医学科学院生物工程研究所生产,Oligo(dt)20引物及逆转录酶均为美国Promega公司产品,GELDOC-OTTS凝胶分析系统由美国UVP公司生产。
1.3.1 血浆活性检测 酶联免疫吸附双抗体夹心法(ELISA)检测COX-2的活性。试剂盒平衡至室温,所有标本复溶后严格按试剂盒说明书在规定时间完成操作,试验终止后酶标仪于590 nm处测得所有标本吸光度,根据试剂盒提供公式转换成COX-2活性。
1.3.2 逆转录PCR检测单个核细胞中COX-2mRNA表达Trizol试剂抽提提取单个核细胞总RNA,用核酸分析仪DU800检测RNA浓度和纯度。取2 μg总RNA,加入Oligo(dt)20引物及逆转录酶在25 μl体积下,行以下热处理:30℃,10 min;42℃,20 min;99℃,5 min;4℃,5 min;最后瞬间离心。完成逆转录反应后,进行聚合酶链反应。COX-2引物序列为:上游 5′-TGAAACCCACTCCAAACACA-3′,下游 5′-TGGAACAACTGCTCATCACC-3;β-actin 引物序列为:上游 5′-CGT GACATTAAGGAGAAGCTG-3′,下 游 5′-CTCAGGAGGAGCAATGATCTTGAT-3′,均由上海生物工程公司合成。反应条件 COX-2 为:94℃,30 s;55℃,1 min;72℃,2 min;72℃,10 min,35 个循环;β-actin 为:94℃,1 min;56℃,1 min;72℃,1 min;72℃,7 min,35个循环。COX-2、β-actin的扩增产物分别为728 bp和375 bp。经2%琼脂糖凝胶电泳,利用GELDOC-OTTS系统对扩增产物条带进行扫描,以COX-2/β-actin的吸光度(A值)作为COX-2mRNA表达的相对含量。
见表1。
表1 COX-2在亚临床AS组与对照组中比较(±s)
表1 COX-2在亚临床AS组与对照组中比较(±s)
与正常对照组比较,*P<0.05,**P<0.01
组别 例数(n) COX-2(U/L) COX-2mRNA(A值)亚临床AS组正常对照组100 40 10.84±3.11*6.97±1.25 0.244 8±0.090 3**0.005 8±0.002 7
直线相关分析发现血浆COX-2活性和血液中单个核细胞COX-2mRNA 表达之间呈正相关(r=0.791,P<0.05)。
COX-2具有“炎症应答基因”的特点,能引起炎症部位的PGI2、PGE2和PGE1等的含量增加,促进炎症反应,加重组织损伤。而COX-2诱导和表达增加又引起炎症反应的放大和增强:COX-2可诱导血管生长因子合成,使新生血管增多而促进了粥样斑块病变的发生和发展[3]。Belton等[4]对42名进行外科血管重建手术的AS患者进行研究,通过免疫组化及RT-PCR方法,发现COX-2在AS区域表达。不仅如此,涉及AS形成过程的促炎症反应介质,包括肿瘤坏死因子(TNF)、白细胞介素(IL)-1、干扰素(IFN)-α等炎症因子、缺氧以及切应力刺激等,均可诱导COX-2表达[5]。文献有关血浆COX-2活性检测和血液中单个核细胞COX-2mRNA表达水平的研究报道并不多,本研究发现:在亚临床AS阶段,血液中即可检测到低水平的COX-2表达。
亚临床冠状动脉粥样硬化是指有动脉粥样硬化的易患因素如年龄、性别、吸烟、肥胖、高血压、高血脂、糖尿病以及胰岛素抵抗等,而无冠状动脉粥样硬化的临床表现。动脉粥样硬化是多种心脑血管疾病的病理基础,除了传统易患因素,近年一些非传统易患因素越来越引起人们的重视,如Hcy、炎症、hs-CRP、氧化修饰脂蛋白等。已有证据表明[6]:COX作为前列腺素(PG)合成过程中的一个限速酶,在炎性反应中起重要的调控作用。当COX-2大量被诱导生成和表达时,炎性反应被放大和增强。COX-2还可诱导血管生长因子合成,使新生血管增多,促进粥样斑块病变的发生和发展[7]。因此降低细胞中COX-2表达是治疗动脉粥样硬化的一个关键环节。选择性COX-2抑制剂可以抑制血管炎症,因而可以减少单核细胞浸润,延缓AS进程,增加斑块稳定性从而减少粥样硬化血栓事件[8]。
表1显示亚临床AS组血浆COX-2活性显著高于对照组,血液中单个核细胞COX-2mRNA表达亚临床AS组非常显著高于对照组。说明在亚临床AS阶段,局部炎症部位有COX-2表达增高而释放入血。两种方法之间显著相关(r=0.791,P<0.05)。相对于 COX-2mRNA 检测,血浆中 COX-2检测较为简单,不需要特殊设备,可方便应用于高危人群监测,以便临床进行早期干预,从而可能有助于降低心血管意外发作风险[9]。
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1674-4721(2010)09(b)-074-02
2010-08-09)