Notch信号途径与肾细胞癌发生发展的相关性研究

钟加滕,焦 丹,杨冬艳＊

(1.吉林大学白求恩医学院 病理生理教研室,吉林 长春 130021;2.吉林大学中日联谊医院,吉林 长春 130033)

Notch信号途径与肾细胞癌发生发展的相关性研究

钟加滕1,焦 丹2,杨冬艳2＊

(1.吉林大学白求恩医学院 病理生理教研室,吉林 长春 130021;2.吉林大学中日联谊医院,吉林 长春 130033)

目的通过免疫组织化学方法检测人肾细胞癌中Notch信号途径相关蛋白的表达水平,探究Notch信号途径分子与人肾细胞癌发生发展的可能关系。方法手术方法获得6例肾细胞癌组织标本,通过HE染色和免疫组织化学染色的方法对肾细胞组织和癌旁组织中Notch信号通路受体、配体蛋白表达水平进行检测。结果与癌旁组织相比,癌症组织中Notch信号的受体Notch-1以及配体Jagged-1的表达水平有明显的降低;而相对于癌旁组织,Notch信号途径的另一个受体Notch-2及配体Jagged-2表达水平有明显的升高。结论肾细胞癌的发生与Notch信号途径的表现出了一定的相关性,Notch信号途径可能参与了肾细胞癌的发生与发展。

肾细胞癌;Notch;HE

(Chin J Lab Diagn,2010,14:1006)

肾细胞癌(renal cell carcinoma,RCC)是一种起源于肾小管上皮细胞的恶性肿瘤[1],是泌尿系统最常见的恶性肿瘤之一,在我国泌尿生殖系统恶性肿瘤中发病率仅次于膀胱癌,占全身恶性肿瘤的3%左右[2];在美国,2008年新发 RCC病例大约为5.439万,且不断升高的趋势[3];在欧洲,每年新确诊的患有RCC的病例越有4万人,年死亡率高达50%[4]。Notch信号途径通过相邻细胞间的受体与配体相互作用而被激活,组织的正常发育需要Notch信号途径的精确调控,Notch信号途径的异常调控可引起组织发育异常,并最终导致肿瘤等多种疾病的发生[5]。在细胞命运决定中Notch信号途径在起到关键作用,它与所有源于三个胚层的组织发育有着密切的关系[6]。本研究通过手术方式获得临床肾细胞癌标本,通过HE染色和免疫组化的方法探讨Notch信号途径分子与肾细胞癌发生发展的关系,为寻找肾细胞的病理生理学机制提供一定的方向。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 Hams苏木素染色液、4%多聚甲醛溶液、DAB 为实验室配置;Notch-1、Notch-2、Jagged-1、Jagged-2抗体本购于Santa Cruz公司,其它常规化学试剂均为分析纯产品。

1.2 标本获取与保存 手术获得2008年9月至2009年5月到中日联谊就诊并被诊断为肾细胞癌的患者的肾细胞癌标本,将收集好的标本立即放入4%多聚甲醛溶液中固定。

1.3 HE染色 中性甲醛溶液固定肿瘤组织,石蜡切片。厚度4 μ m;常规脱蜡至水(50℃二甲苯 I,二甲苯 II各25min,100%、95%、90%、80%、75%酒精、蒸馏水依次各5 min);自来水冲洗2 min,苏木精染色液浸染2 min,自来水冲洗1 min,0.5%盐酸乙醇液分化2 s;自来水充分冲洗,蒸馏水冲洗2次;1%稀氨水返蓝数秒,自来水冲洗1 min,伊红染色液浸染1 min;自来水充分冲洗,脱水(85%酒精20 s,90%酒精30 s,95%酒精1min,100%酒精2 min);二甲苯I、二甲苯II透明各2 min。中性树胶封固,晾干。

1.4 肿瘤组织免疫组织化学染色(SABC-HRP法)用一抗检测肿瘤组织细胞内的抗原,再用显色物质标记的二抗检测一抗,放大检测信号,阳性细胞被染为棕色。肿瘤组织切片脱蜡后水洗,蒸馏水洗,PBS洗。3%H2O210 min后自来水充分水洗,蒸馏水洗,PBS洗。热抗原修复或消化将切片置入抗原修复液中,用微波炉加热至沸腾10-20 s。10分钟后再加热一次。再10min后取出冷却,至室温后蒸馏水洗,PBS充分洗。加正常血清封闭20min弃血清后,直接加一抗:兔抗鼠(Bcl-2、Bax和Caspase 3)抗体稀释比例为l:50,37℃孵育1小时。室温1小时,PBS充分洗。加(羊抗兔)通用型IgG抗体(Fab段)IgG/HRP,室温30 min。PBS充分洗。滴加DAB显色剂,在显微镜下观察直至出现棕色细胞。自来水充分洗,苏木精复染3 min。盐酸乙醇分化2min,自来水充分洗。无水乙醇脱水,二甲苯透明,中性树胶封固,晾干观察。

2 结果

2.1 肾细胞组织与癌旁组织HE染色 与癌旁组织相比,肾细胞癌组织HE染色可见细胞排列紧密,生长活跃异型性明显,核具有多形性并且核仁不明显,结果见图1。

Fig.1 HE Staining in each group

2.2 Notch信号通路受体Notch-1和配体Jagged-1免疫组织化学 与癌旁组织相比,癌症组织中受体Notch-1和配体Jagged-1表达水平明显降低,结果见图2和图3。

Fig.2 The Notch-1 protein expression in each group

Fig.3 The Jagged-1 protein expression in each group

2.3 Notch信号通路受体Notch-2和配体Jagged-2免疫组织化学 与癌旁组织相比,癌症组织中受体Notch-2和配体Jagged-2表达水平明显升高,结果见图4和图5。

Fig.4 The Notch-2 protein expression in each group

Fig.5 The Jagged-2 protein expression in each group

3 讨论

Notch分子最早于1919年在果蝇Notch突变中发现,为保守的单次跨膜糖蛋白,哺乳动物有4种Notch受体(Notch 1-4)和 5种Notch配体(Jagged 1,2和Delta 1,3和4),其细胞外段有29-36个不等的表皮生长因子样重复单位(epidermal growth factorlike repeat,简称EGF重复单位)和3个富含半胱氨酸(cystine,Cys)的Lin-12重复单位;细胞质部分则由RAM区、锚蛋白重复单位、转录激活区和1个PEST(proline 、glutamate 、serine 、threonine-rich)序列等组成[7].相邻细胞上的配体与细胞表面的受体结合后,可激活去整合蛋白和金属蛋白水解酶(adisintegrin and metalloprotease,ADAM),在Notch蛋白跨膜域胞外侧发生水解,从而使Notch受体的胞外段与胞内部分发生解离;Notch的胞内段则在γ-Secretase蛋白酶复合体的作用下从细胞膜内侧解离下来并转移至细胞核内,与转录抑制因子CSL等结合,并募集Maml等转录共激活因子,调节靶基因如Hes1、Hey等的转录表达,进而调控细胞的生长和分化等[8].很多实体瘤和血液性疾病中均发现了Notch信号途径分子的异常表达[9-13],越来越多的研究结果显示Notch信号途径与肿瘤的发生有关;但是在不同的肿瘤中Notch信号途径所发挥的作用是不同的,在有些肿瘤中Notch信号途径分子表达水平有明显的身高,而在另外的肿瘤中Notch表达水平可能有明显的下降,Notch信号途径与肿瘤的发生呈现出来双面性;在已经检测了肾细胞癌组织中Notch信号途径分子mRNA表达水平的基础上,我们在本实验中通过HE染色和免疫组化的方法进一步验证肾细胞癌组织的病理学改变以及检测Notch信号途径分子蛋白质表达水平,为肾细胞癌的临床治疗能提供一定的理论依据和方向。

实验结果显示,与癌旁组织相比,Notch信号途径分子Notch-1和Jagged-1的表达水平明显的降低,而Notch信号途径分子Notch-2和Jagged-2的表达水平与癌旁组织相比却有明显的升高,可以看出Notch信号途径与肾细胞癌的发生发展存在一定的相关性,但是Notch信号途径与肾细胞癌的发生之间真正关联性还不确定,还需要我们进行进一步研究。

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The research on correlation of Notch signaling pathway and the development of renal cell carcinomaorrelational

ZHONG Jia-teng,JIAO Dan,YANG Dong-yan.(Department of Pathphysiology,Norman Bethune College of Medicine,Jilin University,Changchun130021,China)

ObjectiveTo detect human renal cell carcinoma in the Notch signaling pathway-related protein expression levels By immunohistochemistry and explore possible relationship between Notch signaling pathway molecular and human renal cell carcinoma development.MethodsObtain 6 casesof renal cell carcinoma by surgical methods to specimens of and detecte Notch signaling pathway receptor and ligand protein levelsby HE staining and immunohistochemical staining methods on renal tissue and adjacent tissues.ResultsCompared with the adjacent tissues,cancer tissues of the receptor Notch signaling Notch-1 and the ligand Jagged-1 expression significantly reduced,but relative to the adjacent tissues,another Notch signaling pathway receptor Notch-2 as well as the ligand Jagged-2 expression level significantly increased.ConclusionThe occurrence of renal cell carcinoma and Notch signaling pathway showed a certain correlation,Notch signaling pathway may be involved in the occurrence of renal cell carcinoma and development.

RCC;Notch;HE

R737.11

A

1007-4287(2010)07-1006-03

吉林省科技发展计划项目(200705316)

*通讯作者

2009-05-22)