胰岛素抵抗大鼠肝脏组织PERK和p-PERK的表达及意义

林志楠，罗红飞，都健，裴丽娜，刘佳，郭宁宁，张克莹

（中国医科大学 附属第一医院内分泌科，沈阳 110001）

2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）发病的两个关键因素是胰岛素抵抗（insulin resistance，IR）和胰岛β细胞功能障碍［1］。近年来多项研究表明，内质网应激（endoplasmic reticulum stress，ERS）在IR的发生过程中发挥着重要作用［2］。本研究通过高脂喂养并经高血浆胰岛素-正常血糖钳夹技术评估胰岛素抵抗大鼠模型，在此基础上采用Western blot方法检测大鼠肝脏组织ERS标志分子PKR样内质网调节激酶（PKR-like endoplasmic reticulum regulating kinase，PERK） 和磷酸化 PERK（phosphorylated PKR like endoplasmic reticulum regulating kinase，p-PERK）蛋白表达水平的变化，探讨IR发生的分子机制。

1 材料与方法

1.1 胰岛素抵抗大鼠模型的建立

具体方法参照文献［3］。SPF级4周龄雄性Wistar大鼠30只，体质量80～120 g，购自中国医科大学实验动物中心。大鼠适应性喂养1周后，随机分为正常饮食组（NC组，n=15）和高脂饮食组（HF组，n=15）。大鼠饲养于中国医科大学实验动物中心屏障系统中，温度控制在（23±2）℃，湿度控制在60%左右，明暗交替周期为12 h。NC组给予基础饲料喂养，作为对照组。HF组给予高脂饲料喂养，建立胰岛素抵抗大鼠模型。每周固定时间监测大鼠体质量和尾静脉血糖。10周后，每组随机抽取5只行高血浆胰岛素-正常血糖钳夹（hyperinsulinemic-euglycemic clamp，HEC）以评估胰岛素抵抗大鼠模型建立。基础饲料配方参照文献［3］。高脂饲料配方：100g高脂饲料含基础饲料60 g、新鲜猪油30 g、低脂奶粉10 g；热量比：蛋白质14%，脂肪59%，碳水化合物27%。

1.2 高血浆胰岛素-正常血糖钳夹试验

具体方法参照文献［4］。左颈总动脉接肝素生理盐水注射器，右股静脉接三通管后分别接装有40 mU/mL的人胰岛素注射液（丹麦诺和诺德公司产品）和10%葡萄糖注射液的50 ml注射器，再接微量输液泵。静置30 min后，颈总动脉取血1 ml测基础血糖和基础胰岛素。首先输注胰岛素，输注率1.67 mU·kg-1·min-1，每 5 min 颈动脉取血 1 滴测血糖，当血糖>（基础值±0.5）mmol/L时开始输注葡萄糖，输注率从 4～6 mg·kg-1·min-1开始。每 5 min 测血糖1次，调整葡萄糖输注率（glucose infusion rate，GIR），使血糖保持在（基础值±0.5）mmol/L，连续 3次血糖都在上述范围内，钳夹形成。实验共计约2 h，计算60～120 min的平均GIR，评价胰岛素的敏感性。颈动脉血样4℃，3 000g，离心15 min，分离血清置－80℃冰箱冻存。

1.3 标本采集

NC组和HF组未做钳夹的20只大鼠禁食16 h，经10%水合氯醛（0.3 mg/kg）腹腔内麻醉后，腹主动脉穿刺取血约4 ml，4℃、3 000g、离心15 min后，分离血清置-80℃冰箱冻存。肝脏组织剪成约100 mg大小的组织块，剔除血管和其他结缔组织，清洗后蘸干，放入1.5 ml EP管中于-80℃冰箱中冻存。

1.4 Western blot方法测定肝脏组织PERK和p-PERK蛋白

取肝脏组织100 mg，加入1 ml蛋白裂解液，超声匀浆静置30 min后，4℃，12 000g，离心30 min，取上清，BCA法蛋白定量。取含总蛋白30 μg的样品进行SDS-PAGE电泳，湿转法将蛋白条带转移到PVDF膜上，用含5%脱脂奶粉的TBST封闭1 h后依次加入一抗（兔抗大鼠PERK单克隆抗体，1∶500稀释）、二抗（辣根过氧化酶标记的山羊抗兔单克隆抗体，1∶5 000稀释），洗膜后用增强化学发光法显像，用凝胶图像分析系统分析结果。检测p-PERK蛋白水平时一抗为兔抗大鼠p-PERK单克隆抗体（1∶1 000稀释），二抗为辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔多克隆抗体（1∶5 000稀释）。

1.5 血清胰岛素水平检测

取100 μl冻存的血清，应用大鼠胰岛素ELISA试剂盒（R&D公司），依据说明书进行操作，检测基础状态下的血清胰岛素水平。

1.6 统计学处理

应用SPSS 13.0统计分析软件处理实验数据，正态分布资料以±s表示，组间差异比较采用完全随机设计的两独立样本t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组大鼠一般情况比较

喂养10周后，NC组和HF组大鼠体质量和基础血糖水平差异无统计学意义（P＞0.05）；HF组基础胰岛素水平高于NC组，且有统计学意义（P＜0.05）；HF组血清甘油三酯水平高于NC组，且有显著统计学意义（P＜0.01）。见表1。

表1 两组大鼠一般情况比较（n，±s）Tab.1 Comparison ofgeneralconditions between 2 groups（n，±s）

表1 两组大鼠一般情况比较（n，±s）Tab.1 Comparison ofgeneralconditions between 2 groups（n，±s）

NC，normal diet group；HF，high-fat diet group；BM，body mass；TG，triglyceride；BBI，baseline blood insulin；BBG，baseline blood glucose，Compared with NC group，1）P<0.01，2）P<0.05.

Group n BM（g） TG（mmol/l）NC 10 303.13±33.37 0.14±0.07 BBI（mmol/l） BBG（mmol/l）13.94±2.97 6.08±0.34 HF 10 303.87±20.67 0.29±0.111） 15.87±1.972） 6.58±0.81

2.2 两组大鼠高血浆胰岛素-正常血糖钳夹实验结果比较

HF组大鼠60～120 min的平均葡萄糖输注率（GIR60～120）低于NC组，且有显著统计学意义（0.90±0.15 mg·kg-1·min-1vs 4.97±0.68 mg·kg-1·min-1，P<0.01）。见图 1。

2.3 两组大鼠肝脏组织PERK，p-PERK蛋白的表达水平比较

NC组和HF组大鼠肝脏组织PERK表达水平差异无统计学意义（P＞0.05）；HF组大鼠肝脏组织p-PERK表达水平及p-PERK/PERK高于NC组，且有统计学意义（P<0.05）。见表2和图2。

表2 两组大鼠肝脏PERK、p-PERK蛋白表达水平比较Tab.2 Comparison ofthe levels ofPERKand p-PERKprotein in the livers between 2 groups

3 讨论

IR是指胰岛素作用的靶组织（主要是骨骼肌、肝脏和脂肪组织）对外周胰岛素的反应性和敏感性下降［5］。近年来提出了IR的炎症病因学说、氧化应激学说和炎症-氧化应激-炎症学说等，但引发细胞应激的起源尚不清楚。2005年，日本学者Nakatani等［6］首次报道了ERS参与IR和糖尿病的发病。

内质网是哺乳动物细胞内分泌蛋白和膜蛋白合成与翻译后修饰、多肽链正确折叠与装配的重要场所，对应激极为敏感。持续的ERS发生在胰岛素作用的靶组织可以引起IR。Ozcan等［7］建立了高脂饮食诱导和ob/ob基因型肥胖小鼠模型，发现肥胖小鼠肝脏组织中ERS标志分子PERK、eIF2α和JNK的磷酸化水平等显著升高。Kaneto等［8］发现ERS可通过IRE-1α-JNK信号通路减弱Akt的磷酸化和促进IRS-1丝氨酸磷酸化而致IR。但ERS导致IR的具体机制尚未完全明确。

PERK是内质网膜上的感应蛋白，在ERS时PERK磷酸化而活化，活化的PERK一方面通过磷酸化eIF2α，减少蛋白合成而缓解ERS；另一方面也能选择性地增加转录因子ATF4及CHOP的表达而激活其下游通路［9］。本研究结果显示HF组大鼠基础胰岛素水平高于NC组（P＜0.05），并且HF组大鼠GIR60～120低于NC组（P＜0.01），证实IR 大鼠模型成功建立；肝脏组织PERK和p-PERK蛋白的表达上，HF组大鼠肝脏组织PERK的表达水平与NC组相比无统计学差异（P＞0.05），而p-PERK表达显著升高（P＜ 0.05），这与文献报道一致［7］。另外 HF 组大鼠肝脏组织p-PERK/PERK的比值也升高（P＜0.05），证实在高脂饮食诱导的IR大鼠模型中存在ERS。在本研究中PERK的表达两组没有统计学差异可能是因为PERK在生理状态下也表达，而在ERS时表达水平升高，但这不是ERS特征性的变化。ERS时一部分PERK通过磷酸化而活化，从而激活其下游的通路。采用p-PERK/PERK的比值可以消除总PERK蛋白变化的干扰。本研究高脂饲料配方中新鲜猪油的主要成分是饱和脂肪酸，10周高脂饲料喂养后，与NC组相比，HF组大鼠体质量和基础血糖无明显差异（P＞0.05），而血清TG水平显著升高（P＜0.01），HF组大鼠肝脏组织p-PERK蛋白的表达水平也明显升高（P＜0.05），并且基础胰岛素水平也显著升高（P＜0.05）。这些结果表明高脂喂养可能通过脂毒性造成肝脏组织ERS，从而引起IR。有研究［10］显示，营养信号和ERS可以激活PERK，活化的PERK通过激活重要的炎症激酶c-Jun氨基端激酶（C-Jun N-terminal kinase，JNK）而调节胰岛素的活性。PERK也可以直接作用于胰岛素受体底物（insulin receptor substrate，IRS）而改变胰岛素的活性。但ERS通过PERK通路介导IR的具体机制尚未明确。

综上所述，高脂喂养可以造成肝脏组织ERS，其可能通过IRE-1α-JNK信号通路和PERK-JNK/IRS信号通路导致IR的发生，但ERS导致IR的具体机制尚未完全明确，有待于进一步研究。

［1］American Diabetes Association.Diagnosis and classification of diabetes mellitus［J］.Diabetes Care，2007，30（suppl1）：S42-S47.

［2］Yoshiuchi K，Kaneto H，Matsuoka TA，et al.Pioglitazone reduces ER stress in the liver：direct monitoring of in vivo ER stress using ER stress-activated indicator transgenic mice［J］.Endocr J，2009，56（9）：1103-1111.

［3］崔丽娟，都健，王娟，等.高脂喂养大鼠肝脏NF-kBp65表达与胰岛素抵抗的相关性［J］.中国实验动物学报，2008，16（6）：417-420.

［4］都健，赵晓娟，刘国良.胰岛素抵抗大鼠内皮依赖性血管舒张功能研究［J］.中华内分泌代谢杂志，2003，19（4）：313-316.

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［6］Nakatani Y，Kaneto H，Kawamori D，et al.Involvement of endoplasmic reticulum stress in insulin resistance and diabetes［J］.J Biol Chem，2005，280（1）：847-851.

［7］Ozcan U，Cao Q，Yilmaz E，et al.Endoplasmic reticulum stress links obesity，insulin action，and type 2 diabetes［J］.Science，2004，306（5695）：457-461.

［8］Kaneto H，Nakatani Y，Kawamori D，et al.Role of oxidative stress，endoplasmic reticulum stress and c-Jun N-terminal kinase in pancreatic beta-celldysfunctionandinsulinresistance［J］.IntJ Biochem Cell Biol，2006，38（5-6）：782-793.

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［10］Nakamura T，Furuhashi M，Li P，et al.Double-stranded RNA-dependent protein kinase links pathogen sensing with stress and metabolic homeostasis［J］.Cell，2010，140（3）：338-348.