膀胱出口梗阻对逼尿肌结构蛋白及转化生长因子β1表达的影响

魏小斌,白志明,刘振湘,吕 蔡

(中南大学湘雅医学院附属海口医院 1 .检验科;2.泌尿外科;海南 海 口 570208)

膀胱出口梗阻对逼尿肌结构蛋白及转化生长因子β1表达的影响

魏小斌1,白志明2,刘振湘2,吕 蔡2

(中南大学湘雅医学院附属海口医院 1 .检验科;2.泌尿外科;海南 海 口 570208)

目的探讨膀胱出口梗阻(BOO)后逼尿肌中结蛋白、波形蛋白、肌球蛋白、肌动蛋白及转化生长因子β1(TGF-β1)mRNA表达的改变。方法应用荧光定量聚合酶链反应(PCR)检测BOO组(16例)和对照组(5例)膀胱上壁组织中结蛋白、波形蛋白、肌球蛋白、肌动蛋白及TGF-β1 mRNA表达。结果BOO组与对照组膀胱重量分别为(92.15±34.89)g和(56.08±20.35)g,(P＜0.05);前列腺内外径比值分别为(0.57±0.16)和(0.18±0.06),(P＜0.05);对照组结蛋白、波形蛋白、肌球蛋白、肌动蛋白及转化生长因子β1 mRNA的表达量分别为(2.4±2.1)×106、(2.2±0.9)×106、(0.60±0.56)×106、(2.63±1.36)×106和(0.18±0.13)×106拷贝数/μ g总 RNA;与对照组相比,BOO 组结蛋白、波形蛋白、肌球蛋白、肌动蛋白及转化生长因子β1 mR NA的表达量均有显著增加,分别为(25.0±31.0)×106、(20.0±25.0)×106、(6.59±5.62)×106、(40.32±59.67)×106和(3.60±7.30)×106拷贝数/μ g总 R NA(P值均＜0.01)。结论膀胱逼尿肌中结蛋白、波形蛋白、肌球蛋白、肌动蛋白及转化生长因子β1 mRNA的表达与逼尿肌的功能状态密切相关。

逼尿肌;膀胱结蛋白;波形蛋白;肌球蛋白;肌动蛋白;转化生长因子β1

(Chin J Lab Diagn,2010,14:1408)

通过尿动力学压力-流率检查筛选病例,应用荧光定量PCR方法检测良性前列腺增生症(BPH)引起膀胱出口梗阻(BOO)病人膀胱逼尿肌组织中结蛋白、波形蛋白、肌球蛋白、肌动蛋白及转化生长因子β1mRNA的表达,以探讨BOO引起膀胱逼尿肌结构及功能改变的可能机制。

1 材料与方法

1.1 临床资料

BOO组16例,均为男性,年龄54-83岁,平均73.8岁,来自2003年6月至2005年6月我院泌尿外科住院患者,入院均诊断为BPH,并行尿动力学压力-流率检查为高压-低流型。对照组5例,平均年龄67.2岁,其中外伤致膀胱破裂1例、尿道断裂2例,输尿管壁间段结石2例,均排除有下尿路梗阻病史可能。以上病例均行开放手术治疗,参照Kojima等[1,2]提出B超预测膀胱重量方法:假设膀胱是一个球体,通过B超测量膀胱壁的厚度以及膀胱容量来测算出膀胱重量。术前行B超检查估算膀胱重量并测量前列腺内外径比值,术中提取膀胱逼尿肌组织标本2 cm×1 cm×1 cm备用。

1.2 主要试剂和仪器

1.2.1 主要试剂 TRIZol(Invitrogen公司),RT-PCR试剂盒(德国QIAGEN公司),5×定量PCR buffer(美国ABI公司),dNTPs(25 mM)(上海生工),上游引物F(25 μ M)(达安基因),下游引物 R(25 μ M)(达安基因),dNTPs(10 mM)(Sigma公司),荧光探针(20 μ M)(达安基因)Taq酶(美国ABI公司)。结蛋白的上、下游引物分别为 :5′-GGAGAGGAGAGCCGGATCA-3′,5′-GGGCTGGTTTCTCGGAAGTT-3′, 探 针 为 5′-FAMTCTCCCCATCCAGACCTACTCTGCCC-TAMRA-3′;波形蛋白 的上、下游引物分别为:5′-ACACCCTGCAATCTTTCAGACA-3′,5′-GATTCCACTTTGCGTTCAAGGT-3′,探针为 5′-FAM-ATGTTGACAATGCGTCTCTGGCACGT-TAMRA-3′;肌球蛋白的上、下游引物分别为 :5′-TCGACGTCACGGGTTACATC-3′,5′-CGAATTGCCCGTGATTTTTC-3′,探 针为 5′-FAM-TGGGAGCCAACATTGAGACCTATCTGCT-TAMRA-3′;肌动蛋白分别为 :5′-GCGCGGCTACAGCTTCA-3′,5′-TCTCCTTAATGT CACGCACGAT-3′,5′-FAM-CACCACGGCCGAGCGGGATAMRA-3′;转化生长因子β1的上、下游引物分别为 :5′-CGAGCCTGAGGCCGACTAC-3′,5′-AGATTTCGTTGTGGGTTTCCA-3′,探 针 为 5′-FAM-CAAGGAGGTCACCCGCGTGC-TAMRA-3′。

1.2.2 仪器 紫外分光光度计(日本SHIMADZU UV mini1240),PE9600 PCR仪(美国 Perkin Elmer公司),荧光定量仪PE7000全自动荧光定量PCR仪(美国 Perkin Elmer公司)。

1.3 组织RNA的提取

组织块(约100 mg)置匀浆器,加TRIZol(100 mg组织加TRIZol2 ml),冷冻匀浆,置Eppendorf管,静置5 min,加入0.2 ml氯仿,盖紧盖子,用力摇动 15 s,静置2-3 min,4℃12 000 r/min离心15 min,取上清液至新的Eppendorf管,加0.5ml异丙醇,静置样品10 min,4℃12,000 r/min(R=8 cm)离心10 min,弃上清液,1 ml 75%乙醇洗涤沉淀1次,4℃7,500 r/min(R=16 cm)离心5min,弃乙醇,空气或真空干燥5-10 min,加焦碳酸二乙酯(diethypyrocarbonate,DEPC)处理水溶解RNA,-80℃保存备用。

1.4 RNA样品鉴定

浓度计算:每份样品在紫外分光光度计上测定波长为260 nm时的吸光度值。浓度计算公式:浓度(g/L)=OD260×稀释倍数×40÷1 000。

1.5 逆转录反应

取 5 μ lRNA模板做逆转录反应,仪器为PE9600PCR仪,反应体系如下:(德国QIAGEN公司RT-PCR试剂盒),5×逆转录 buffer 4 μ L;上游引物0.4 μ L;下游引物 0.4 μ L;dNTPs(25 mM)0.2 μ L;MMLV(10 U/μ L)1 μ L;DEPC 水 9 μ L;RNA 模板 5 μ L;总体积:20 μ L;反应条件 :37℃1 h,然后 95℃3 min 。

1.6 荧光定量PCR反应

用荧光定量仪PE 7000全自动荧光定量PCR仪检测结蛋白、波形蛋白、肌球蛋白、肌动蛋白及转化生长因子β1 mRNA表达。样本按以下反应体系进行 :5 ×定量 PCR buffer10 μ L;上游引物 F(25 μ M)1 μ L,下游引物 R(25 μ M)1 μ L,dNTPs(10 mM)0.5 μ L,荧光探针(20 μ M)1 μ L,Taq 酶 1.5 μ L,cDNA 5 μ L,ddH2O 30 μ L,总体积 :50 μ L,反应条件为:93 ℃2min,然后93℃45 s,55℃1 min,共 40循环。反应结束后,由电脑自动分析并计算结果。结果按B=拷贝数/μ LcDNA进行分析,考虑到各个样本总RNA浓度的差异,最终计算结果按下列公式换算:A(拷贝数/μ g总 RNA)=B(拷贝数/μ LcDNA)÷ OD260×5÷6。

1.7 统计学方法

实验指标的mRNA表达以拷贝数/μ g总RNA表示,组间比较采用非参数Mann-Whitney U检验,组内参数间相关性比较采用Pearson直线相关分析,应用SPSS V11.5统计软件进行分析。

2 结果

2.1 膀胱重量及前列腺内外径比(见表1)

与对照组相比,BOO组膀胱重量明显增加(P＜0.05);前列腺内外径比显著升高(P＜0.05)。

表1 膀胱重量与前列腺内外径比关系(±s)

表1 膀胱重量与前列腺内外径比关系(±s)

注:前列腺内外径比例与膀胱重量的相关系数为:*r=0.521(P＜0.05),**r=-0.05(P＞0.05)

分组 例数 膀胱重量(g) 前列腺内外径比BOO组 16 92.15±34.89 0.57±0.16*对照组 5 56.08±20.35 0.18±0.06**P值 0.017 0.001

2.2 逼尿肌中结蛋白、波形蛋白、肌球蛋白、肌动蛋白及TGF-β1mRNA的表达(见表2)

3 讨论

BOO常导致逼尿肌功能改变,继而产生一系列严重的并发症如尿潴留、尿失禁及肾功能改变等,其中逼尿肌的收缩功能异常是BOO导致膀胱排尿功能障碍的主要原因[3]。BOO可使膀胱组织发生两个变化,即早期逼尿肌的肥大和增生,后期膀胱壁的纤维化,纤维组织代替了逼尿肌组织。通过研究BOO后膀胱逼尿肌形态结构及其功能的变化,对指导BPH的治疗有重要意义。Belenky等[4]提出多普勒超声检测膀胱逼尿肌血流阻力指数(RI)亦可作为诊断BOO的方法之一,结果显示 BOO组在膀胱空虚和充盈状态时逼尿肌 RI指数均高于非BOO组,表明BOO时逼尿肌血流减少。而膀胱逼尿肌的缺血可能是导致其超微结构改变的关键因素[5]。我们通过术前B超检测显示BOO组前列腺内外径比例与膀胱重量之间有明显相关性(P＜0.05),对照组无相关性;同时两组间进行比较,BOO组中膀胱重量明显增加(P＜0.05),前列腺内外径比例也显著升高(P＜0.05),提示BPH引起BOO后会导致膀胱重量明显增加。而膀胱重量的增加是膀胱逼尿肌功能改变的重要原因。许多BOO动物实验的结果提示我们,膀胱重量改变越明显,离体逼尿肌收缩力受损害越大。说明BOO后膀胱重量的增加可能是膀胱功能失代偿的重要标志之一。

表2 结蛋白、波形蛋白、肌球蛋白、肌动蛋白及 TGF-β1mRNA的表达(±s)(单位:×106拷贝数/μ g总RNA)

表2 结蛋白、波形蛋白、肌球蛋白、肌动蛋白及 TGF-β1mRNA的表达(±s)(单位:×106拷贝数/μ g总RNA)

注:与对照组相比,结蛋白、波形蛋白、肌球蛋白、肌动蛋白及转化生长因子β1mRNA的表达量差异具统计学意义(P值均＜0.01)

分组 例数 结蛋白 波形蛋白 肌球蛋白 肌动蛋白 TGF-β1 BOO 组 16 25.0±31.0 20.0±25.0 6.59±5.62 40.32±59.67 3.60±7.30对照组 5 2.4±2.1 2.2±0.9 0.60±0.56 2.63±1.36 0.18±0.13 P值 0.008 0.008 0.004 0.001 0.002

TGF-β是相对分子质量为25 000的双肽链同聚体,包括TGF-β1 、TGF-β2、TGF-β3 和TGF-β1β2 四个亚型。在体内TGF-β1可能是以旁分泌形式作用于上皮细胞,TGF-β1是成纤维细胞和其他间叶细胞强有力的有丝分裂原,能刺激间质细胞生长,还能使碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)产生增加,而bFGF是间质细胞的自分泌刺激因子,能够刺激逼尿肌的成纤维细胞增生,导致膀胱壁的增厚或纤维化。TGF-β1还具有调节细胞外基质成分如纤维连接蛋白、胶原的合成与降解的功能,导致细胞外基质的堆聚,从而增加细胞对生长因子的反应[6]。TGF-β1可促进受损伤的平滑肌细胞合成与分泌细胞外间质成分(如胶原纤维),抑制细胞外基质蛋白的降解,是影响器官纤维化最主要的细胞因子[7]。波形蛋白是中间丝的其中一种蛋白质。中间丝是真核生物细胞的重要结构性特征。它们与微管及肌动蛋白微细丝,组成细胞骨架。Tuxhorn等[8]研究发现TGF-β1诱导人前列腺癌细胞外基质组织中网状蛋白、平滑肌α-肌动蛋白和胶原I的表达增加,间质呈肌成纤维细胞样表现。结蛋白也是一种主要的中间丝蛋白。Malmqvist等[9]和 Berggren等[10]发现与正常对照组相比,BOO组逼尿肌中结蛋白/肌动蛋白比例明显升高。

本研究结果显示,与对照组相比,BOO组结蛋白、波形蛋白、肌球蛋白、肌动蛋白及转化生长因子β1 mRNA的表达量均有显著增加。提示TGF-β1通过促进间质细胞或间质成分合成使细胞外基质成分(如结蛋白、波形蛋白、肌球蛋白、肌动蛋白等)改变、桥接作用增加,导致膀胱逼尿肌收缩障碍或不稳定,是逼尿肌在膀胱流出道梗阻后逐渐出现纤维化病变的重要分子学机制之一,其调控机理有待进一步深入研究。另外,我们认为 BOO后逼尿肌中肌动蛋白、肌球蛋白表达的增加以及肌动/球蛋白比例的上调可能是其收缩功能改变的分子基础,通过及时解除BOO,有望阻断膀胱逼尿肌的病变进程。但由于膀胱逼尿肌的收缩功能同时还受到其他相关因素的影响,如间质成分、生长因子、神经递质等,具体的作用机制也有待进一步深入研究。

[1]Kojima M,Inui E,Ochiai A,et al.Ultrasonic estimation of bladderweight as a measure of bladder hypertrophy inmen with infravesical obstruction:a preliminary report[J].Urology,1996,47(6):942.

[2]Kojima M,Inui E,Ochiai A,et al.Noninvasive quantitative estimation of infravesical obstruction using ultrasonic measurement of bladder weight[J].J Urol,1997,157(2):476.

[3]William D,Steer S,William C.Effect of bladderoutlet obstruction onmicturition reflex pathways in the rats[J].J Urol,1988,140(4):864.

[4]Belenky A,Abarbanel Y,Cohen M,et al.Detrusor resistive index evaluated by Doppler ultrasonography as a potential indicator of bladder outlet obstruction[J].Urology,2003,62(4):647.

[5]Kessler TM,Gerber R,Burkhard FC,et al.Ultrasound assessment of detrusor thickness in men-can it predict bladder outlet obstruction and replace pressure flow study[J].J Urol,2006,175(6):2170.

[6]Baskin LS,Hayward SW,Sutherland RA,et al.Mesenchy-mal-epithelial interactions in the bladder[J].World J Urol,1996,14(5):301.

[7]Morrissey J,Guo G,Moridaira K,et al.Transforming growth factor-beta induces renal epithelial jagged-1 expression in fibrotic disease[J].J Am Soc Nephrol,2002,13(6):1499.

[8]Tuxhorn JA,Arner GE,Smith MJ,et al.Reactive stroma in human prostate cancer:induction of myofibroblast phenotype and extracellular matrix remodeling[J].Clin Cancer Res,2002,8(9):2912.

[9]Malmqvist U,Arner A,Uvelius B.Cytoskeletal and contractile proteins in detrusor smooth muscle from bladders with outlet obstruction-a comparative study in rat and man[J].Scand J Urol Nephrol,1991,25(4):261.

[10]Berggren T,Uvelius B,Arner A.Denervation and outlet obstruction induce a net synthesis of contractile and cytoskeletal proteins in the urinary bladder of the male rat[J].Urol Res,1996,24(3):135.

The effect of bladder outlet obstruction on the expression of detrusor structural proteins and transforming growth factor-β1

WEI Xiao-bin,BAI Zhi-ming,LIU Zhen-xiang,et al.(Affiliated Haikou Hospital ofXiangya Medical College in CentralSouthUniversity,HaiKou570208,China)

ObjectiveTo investigate the change in expression of detrusor desmin,vimentin,myosin,actin and transforming growth factor-β1 mRNA following bladder outlet obstruction(BOO)in patients.MethodsFluorescent quantitation PCR was applied for detecting the mRNA expression of detrusor desmin,vimentin,myosin,actin and transforming growth factor-β1 between 16 patients of BOO and 5 patientswith trauma as control group.ResultsThe bladder weights of BOO and control group were(92.15±34.89)g and(56.08±20.35)g respectively(P＜0.05);and the ratio of prostate exterior and interior diameter were(0.57±0.16)and(0.18±0.06),respectively(P＜0.05).The expression of desmin,vimentin,myosin,actin and transforming growth factor-β1 mR NA were(2.4±2.1)×106、(2.2±0.9)×106、(0.60±0.56)×106、(2.63±1.36)×106and(0.18±0.13)×106copy number/μ g total RNA in control group respectively.When compared with control group,the expression of desmin,vimentin,myosin,actin and transforming growth factor-β1mRNA were significant increase(P＜0.01)and were(25.0 ±31.0)×106、(20.0±25.0)×106、(6.59±5.62)×106、(40.32±59.67)×106and(3.60±7.30)×106copy number/μ g total RNA in BOO group respectively.ConclusionThe expression of detrusor desmin,vimentin,myosin,actin and transforming growth factor-β1 mRNA is closely correlatedwith detrusor function following BOO.

Detrusor;Bladder;Desmin;Vimentin;Myosin;Actin;Transforming growth factor-β1

R691.3

A

1007-4287(2010)09-1408-04

魏小斌(1972-),男,副主任技师,硕士,硕士生导师,检验科副主任。

2010-01-15)