重组腺病毒载体携带反义微小RNA-21对膀胱癌细胞生长的作用

朱德淳,李然伟,刘禄成,温都苏,魏 巍

(吉林大学第二医院泌尿外科,吉林长春 130041)

重组腺病毒载体携带反义微小RNA-21对膀胱癌细胞生长的作用

朱德淳,李然伟,刘禄成,温都苏,魏 巍

(吉林大学第二医院泌尿外科,吉林长春 130041)

目的探讨重组腺病毒载体介导的微小RNA-21(miRNA-21)反义寡核苷酸(ASOND)对人膀胱癌细胞株T24生长的影响。方法构建反向插入miRNA-21基因的重组腺病毒载体(rAV-miRNA-21),并用反义rAV-miRNA-21转染T24,即病毒载体用药组。采用噻唑蓝(MTT)法和原位末端标记(TUNEL)法检测T24细胞的增殖和凋亡情况。同时设对照组和空病毒组作为对比。结果rAV-miRNA-21用药组、对照组和空病毒组T24细胞的增殖率分别为(37.1±6.8)%、(95.7±5.8)%、(86.3±7.5)%;凋亡率分别是(31.6±4.7)%、(8.4±2.9)%、(7.3±4.6)%。 用药组的增殖率和凋亡率分别与对照组和空病毒组相比较,差异均有统计学意义(P＜0.01),而对照组与空病毒组之间差异无统计学意义(P＞0.05)。结论反义miRNA-21重组腺病毒载体转染T24细胞可以抑制肿瘤细胞增殖,增加细胞凋亡,进而抑制膀胱癌细胞生长。

膀胱肿瘤;微小 RNA-21;重组腺病毒;基因治疗

(Chin J Lab Diagn,2010,14:1351)

膀胱癌细胞能过度表达癌基因微小RNA-21(miRNA-21),其表达与膀胱癌的发生发展密切相关,高miRNA-21表达的患者预后不良[1,2]。本研究通过构建反向携带miRNA-21基因的重组腺病毒载体(rAV-miRNA-21),观察miRNA-21反义寡核苷酸(antisense oligonucleotides,ASOND)对人膀胱癌细胞株T24增殖和凋亡的影响,从而为膀胱癌的基因治疗寻找更为有效的新方法并提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 细胞及主要试剂 人膀胱癌细胞株T24购自中国科学院上海细胞所。腺病毒表达载体PDC316-EGFP-U6系统购自本元正阳公司。限制性内切酶等各种工具酶购自BioLabs公司。反义和随机对照寡核苷酸购自上海吉玛制药技术有限公司。反义miRNA-21 序列(AS-miRNA-21)为 5′CTCAACTGGTGTCGGCAACATCG3′,随机对照序列为5′UCUACUCUUUCUAGGUUGUGA3′。在 Genbank中行 Blastn证实ASOND与任何已知哺乳动物基因无匹配。反义miRNA-21重组腺病毒载体(rAV-miRNA-21)的制备方法参考文献[3]。

1.2 方法 ①检测反义rAV-EGFP对T24细胞的转染率:取对数生长期的T24细胞接种于96孔培养板,每组3复孔,每孔细胞数为1×103个,37℃培养24 h后更换培养液,继续培养68 h后每孔分别加入含rAV-EGFP的培养液,37℃孵育4 h,轻轻吸去上清后分别用荧光显微镜和流式细胞仪观察并测定荧光蛋白(EGFP)表达情况。②评价反义rAV-miRNA-21对T24细胞增殖的影响:取对数生长期的T24细胞,分别加入rAV-miRNA-21和rAV-MCS,68h后提取细胞基因组,PCR扩增反义miRNA-21目的片段,凝胶电泳正确后测序,测序正确后取对数生长期的T24细胞,相差显微镜观察感染细胞变化,MTT染色及电镜观察细胞状态,最后用MTT比色法检测T24细胞增殖率。③测定反义rAV-miRNA-21诱导T24细胞凋亡率:按照反义rAV-miRNA-21组(病毒载体用药组),rAV-MCS组(空病毒组)和空白对照组分为3组。每组取对数生长期的T24细胞分别接种于96孔培养板,每组3复孔,每孔细胞数为1×103个,37℃培养24 h后轻轻吸去上清。每组分别加进rAV-miRNA-21、rAV-MCS和生理盐水。继续培养68 h后每孔分别加TUNEL反应液,37℃孵育4 h后弃上清。用原位末端标记(TUNEL)法检测T24细胞凋亡率。实验重复3次,结果取3孔平均值。

1.3 统计学方法 实验数据用SPSS统计学软件处理,组间差异比较用 t检验,结果用±s表示,P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 rAV-EGFP对T24细胞的转染 rAV-EGFP转染T24细胞68h后用荧光显微镜看到大量细胞表达有绿色荧光蛋白编码基因(EGFP)的腺病毒,荧光蛋白表达率接近100%,绿色荧光分布在以细胞核为主的整个细胞中,见图1。

图1 绿色荧光蛋白(EGFP)在T24细胞表达结果

2.2 rAV的生物活性 在T24细胞被转染病毒颗粒68 h后提取细胞基因组,PCR扩增目的基因片段,1%凝胶电泳见到大约1.5 Kb长的基因片段,测序结果与预期序列一致。提示反义rAV-miRNA-21能够感染T24细胞,具有生物活性,见图2。

图2 反义 miRNA-21重组腺病毒在T24细胞表达结果

2.3 T24细胞增殖率 MTT比色法分别检测反义rAV-miRNA-21组、rAV-MCS组和空白对照组T24细胞增殖率。3组结果见表1。rAV-miRNA-21组和另外两组间分别比较,差异有统计学意义(P＜0.01),而rAV-MCS和对照组比较,差异无统计学意义(P＞0.05)。上述统计结果表明反义rAV-miRNA-21具有抑制T24细胞增殖的生物学活性。

2.4 T24细胞凋亡率 TUNEL法检测3组T24细胞凋亡率的结果见表1。显示病毒载体用药组分别与空病毒组和空白对照组相比较,差异均有统计学意义(P＜0.01)。而空病毒组与空白对照组比较,诧异无统计学意义(P＞0.05)。提示反义rAV-miRNA-21在单细胞水平可以诱导肿瘤细胞凋亡,见图3。

表1 各组 T24细胞增殖率和凋亡率的比较(±s)

表1 各组 T24细胞增殖率和凋亡率的比较(±s)

注:与rAV-MCS组比较,※P＜0.01;与空白对照组比较,△P＜0.01

组别 n T24细胞增殖率(%)T24细胞凋亡率(%)反义 rA V-miRNA-21组 50 37.1±6.8※△ 31.6±4.7 rAV-MCS组 30 86.3±7.5 8.4±2.9空白对照组 30 95.7±5.8 7.3±4.6

3 讨论

微小RNA(miRNA)参与细胞增殖和凋亡,在肿瘤发生发展过程中起重要的调控作用。miRNA-21是最常见的表达上调miRNA,具有促进细胞增殖,抑制细胞凋亡,进而加速肿瘤生长转移的作用。miRNA-21的这些作用,主要是通过调控程序性细胞死亡因子4(PDCD4)和抑癌基因(PTEN)及TPM1来实现[4-6]。由于上述促凋亡因子和抑癌基因与膀胱肿瘤的发生发展也密切相关,所以我们通过观察重组腺病毒载体携带反义miRNA-21对膀胱癌T24细胞增殖和凋亡的影响,探索以miRNA-21为靶点治疗膀胱癌的可能性。

图3 TUNEL法检测不同3组T24细胞凋亡率结果

本研究发现,转染反义rAV-miRNA-21的T24细胞增殖率降低,凋亡率增加与未转染反义rAV-miRNA-21的空病毒组和空白对照组的T24细胞增殖率和凋亡率分别比较,差异均有统计学意义(P＜0.01),而未转染反义rAV-miRNA-21的两组相比较,差异则无统计学意义(P＞0.05)。提示:①膀胱癌组织中存在miRNA表达失衡,对高表达miRNA-21的膀胱癌细胞,可以通过反义技术有效抑制;②利用miRNA-21模拟物或阻碍物,通过转染肿瘤细胞可能有助于抑制肿瘤的生长转移。这为以miRNA-21为目标的膀胱癌靶向基因治疗提供了新的初浅的实验依据。

[1]Neely LA,RiegerChrist,Neto BS,et al.A microRNA expressionratio defining the invasive phenotype in bladder tumor[J].Urol Oncol,2008,15:155.

[2]Zhu S,Si ML,Wu H,et al.MicroRNA-21 targets the tumor suppressor gene tropomyosin[J].J Biol Chem,2007,19:14328.

[3]So A,Rocchi P,Gleave M.Antisense oligonucleotide therapy in the management of bladder cancer[J].CurrOpin Urol,2005,15:320.

[4]Li T,Li D,Sha J,et al.MicroRNA-21 directly targets MARCKS and promotes apoptosis resistance and invasion in prostate cancer cells[J].Biochem Biophys Res Commun,2009,383(3):280.

[5]Huang GL,Zhang XH,Guo GL,et al.Clinical signifcance of miRNA-21 expression in breast cancer[J].Oncol Rep,2009,21(3):673.

[6]Zhu S,Si ML,Wu H,et al.MicroRNA-21 targets the tumor suppressor gene tropomyosin1(TPM1)[J].J Biol Chem,2007,282(19):14328.

Recombinant adenovirus vector with antisense miRNA-21 affect bladder cancer cell growth

ZHU De-chun,LI Ran-wei,LIU Lu-cheng,et al.(Department of Urology,The Second Hospital of Jilin University,Changchun130041,China)

ObjectiveTo explore miRNA-21 antisense oligonucleotide mediated by recombinant adenovirus vector affect human bladder cancer cell line T24 growth.MethodsTo construct inverted insertion miRNA-21gene recombinant adenovirus vector(rAV-miR NA-21),and use rAV-miRNA-21 transfect T24,that is viral vector medication group.Adopting MTT and TUNEL detect proliferation and apoptosis status.Simultaneously set up control group and take vacancy viral group as comparison.ResultsThe T24 growth rates of rAV-miRNA-21group、control groupand vacancy viral group are(37.1±6.8)%,(95.7±5.8)%and(86.3±7.5)%,the apoptosis rates are(31.6±4.7)%,(8.4±2.9)%and(7.3±4.6)%.Compare proliferation and apoptosis of rAV-miRNA-21 group miRNA-21 groupwith control group and vacancy viral group,difference has statistical significance(P＜0.05),but between control group and vacancy viral group difference has nonsignificance(P＞0.05).ConclusionAntisense miRNA-21 recombinant adenovirus vector transfect T24 couldinhibit proliferation of tumor cell and increase tumor cell apoptosis,and so inhibit bladder cancer cell growth.

bladder cancer;miRNA-21;recombinant adenovirus;gene therapy

R735.14

A

1007-4287(2010)09-1351-03

国家自然科学基金资助课题(30972981)

朱德淳,53岁,男,硕士生导师,教授,主要从事泌尿肿瘤的早期诊断和治疗研究。

2010-01-05)