核酸扩增新技术*

鲁 雪,李 赟,黄 倢

(1.中国海洋大学水产学院,山东青岛 266003;2.中国水产科学研究院黄海水产研究所,农业部海洋渔业资源可持续利用重点开放实验室,山东青岛 266071)

聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)是体外扩增 DNA序列的技术,它的基本原理类似于DNA的天然复制过程。自1985年PCR技术建立以来[1],该技术不断发展,逐渐成为分子生物学、基因组学、疾病诊断等领域的基本研究手段。PCR反应过程包括变性、退火和延伸三个阶段,因此PCR技术需要特殊的热循环仪器,耗时长(2 h～3 h)。由于PCR技术灵敏度高,容易产生假阳性反应,并且,由于检测形式单一,结果不易判读[2]。因此,亟需更加有效的核酸扩增方法来替代PCR技术。目前,在聚合酶链反应这一基本原理的基础上发展出来一系列新的核酸扩增概念和实验方法,本文简要介绍了几种新的核酸扩增技术。

1 环介导等温扩增技术

环介导的等温扩增技术(loop-mediated isothermalamp lification,LAMP)是一种简单、快速、特异性强、耗费低的核酸扩增技术,可以在等温条件下一步完成。LAM P技术的过程可以分为三个阶段,即起始阶段,循环扩增阶段以及延伸阶段。由于原理比较复杂,可以通过网站上的动画了解其过程[3]。LAMP技术利用具有链置换活性的DNA聚合酶(Bst DNA polymerase),以及针对目的基因的6个不同区域设计的2条内引物(FIP,BIP)和2条外引物(F3,B3)进行等温扩增[4]。这一扩增反应是恒温进行的链置换反应。将样品、引物、DNA聚合酶混合物在63℃温育,基因的扩增和检测可以一步完成。与PCR技术和荧光定量 PCR技术相比,LAMP技术更加简单、特异性和灵敏度更高。LAMP的高特异性和高灵敏度是基于恒温条件下进行的连续扩增,其扩增的高效性产生了大量的副产物和焦磷酸根离子,焦磷酸根离子与反应液中的镁离子结合形成焦磷酸镁白色沉淀。随着DNA的不断合成,焦磷酸镁沉淀量不断增加,反应混合物的混浊度也不断增大。根据这一关系,实时测量反应混和物的混浊度可以实现实时监测LAMP反应的进程[5]。

作为一种恒温扩增反应,LAMP技术不需要热循环,因此使用简单的金属浴或者水浴就可以进行反应,同时,LAMP技术不需要特别的试剂。由于对设备和试剂的要求低,LAMP技术的成本也比较低。在LAMP反应中,扩增和监测同时在指数生长期完成,而不是平台期,因此可以避免平台期出现的假阳性反应而造成的低灵敏度[6]。此外,只有当靶基因的6个区域全部被引物准确识别时,扩增反应才能进行,因此LAMP技术具有很高的特异性。加入反转录酶还可以直接从RNA扩增DNA(RTLAMP)[7]。

LAM P技术原理虽然复杂,但是实际操作过程却十分简单,是一种简单、快速、有效的核酸扩增技术。黄倢,张庆利等[8-9]近年来,研发出对虾白斑综合征病毒核酸等温扩增检测试剂盒,以及大菱鲆红体病虹彩病毒环介导等温扩增检测方法。LAMP技术诊断试剂盒的研发,将会给研究人员带来更大的便利,市场前景将十分广阔。

2 赖解旋酶恒温基因扩增技术

赖解旋酶恒温基因扩增技术(helicase-dependent isothermal DNA am plification,HDA)是美国 New England Biolabs的研究人员近年来研究出来的一种新型体外恒温基因扩增技术[10]。该技术在恒温(62℃～65℃)下进行,依赖解旋酶、单链结合蛋白和DNA聚合酶。其基本原理是:首先,解旋酶打开DNA双链,形成单链DNA;其次,单链结合蛋白(SSB)与之结合,保持单链 DNA稳定性;接下来,在DNA聚合酶的作用下催化生成新的双链DNA,新生成的双链DNA成为下一轮扩增的模板,如此重复,DNA的量呈指数增加。

目前常用的解旋酶是大肠埃希菌 UvrD解旋酶[10-11],还有一种解旋酶是T7噬菌体基因4编码蛋白,与大肠埃希菌UvrD解旋酶相比较,其解链速度更快,扩增长度更长[12-13];常用的单链结合蛋白(SSB)有T4噬菌体基因32编码蛋白,以及RB49噬菌体基因32编码蛋白[10];常用的DNA聚合酶则选择Bst酶,或者 K lenow Fragment聚合酶[10,14]。

HDA技术与其他恒温基因扩增技术相比,优势在于其DNA循环复制体系。由于其解旋酶不需要热变性就可以打开DNA双链,使得HDA技术的反应程序十分简单,恒温条件下就可以完成,这一优势使其成为核酸体外扩增的有利手段[12]。

3 固相PCR技术

固相PCR(solid phase PCR)技术是在固体表面进行的核酸扩增技术。它是将引物通过各种共价键结合到固相基质上,使扩增反应在固相基质表面进行。自Adessi C等[15]于2000年发明了这种技术以来,许多研究者对这项技术进行了优化,以期其能够替代常规PCR技术。固相支持物有琼脂糖小珠,聚丙烯酰胺小珠、乳胶小珠、磁珠、硅片、玻片以及尼龙膜等[16]。固定引物有许多种不同的化学方法,其中,引物5′末端修饰巯基后,通过偶联剂将其共价结合到氨基硅烷化玻片上的效果最好[15]。

固相PCR技术可以解决多重PCR技术难以克服的问题:当许多不同的引物对作为反应物同时出现在同一PCR体系中,引物之间、引物和模板之间容易产生错配,因而降低了反应的特异性。固相PCR技术将引物固定在固相支持物表面,可以在空间上阻止引物彼此接触而形成的二聚体。但是,这一技术同样会导致反应效率降低,以及支持物表面反应物的损失。M euzelaar L S等[17]于2007年发明了MegaPlex PCR技术,这一技术首先将扩增基因的特异引物固定到磁珠上,反应起始阶段,特异引物起作用,在固相支持物表面扩增出一定拷贝的模板,随后引入一种通用引物,替代特异引物,该通用引物在反应液中继续扩增,这样可以充分提高反应效率。MegaPlex PCR是一种创新的固相PCR技术,可以很好地实现高通量的多重PCR。

4 指数富集配体的系统进化技术

指数富集配体的系统进化技术(systematic evolution of ligands by exponential enrichment,SELEX)是20世纪90年代初由Tuerk C和Gold L发明的一种新型组织化学技术[18]。其基本原理是:首先在体外合成一个大量的随机寡核苷酸库(SSR),每条寡核苷酸由两端的固定序列和中间的随机序列构成,随机序列长度在20个～40个碱基之间。将靶分子与该随机寡核苷酸库混合,靶分子会与寡核苷酸(RNA或 ssDNA)“适配子”结合形成复合物,再将该复合物分离,洗脱下寡核苷酸,以其为模板进行PCR扩增,来制备下一轮的寡核苷酸文库。经过结合-分离-洗脱-加倍这一过程的反复筛选,与靶分子亲和力高的“适配子”便从随机寡核苷酸库中分离出来,并且其纯度也不断增高,最终可以占据库的90%以上[18]。

通常随机寡核苷酸库的容量是1014～1015个寡核苷酸序列。由于寡核苷酸“适配子”能够形成多种三维构象,它们几乎可以与自然界所有种类的分子结合[19],从大分子如氨基酸多肽、核酸、复杂药物高分子,到有机小分子,甚至是金属离子,这些“适配子”对它们都具有很高的亲和力,因此“适配子”被广泛的应用于医药学基础研究、药物开发、体外诊断和体内治疗[20]。由于寡核苷酸“适配子”只识别那些具有与之互补空间结构的分子,因此其识别特异性非常高。根据Jenison等研究发现,用茶碱筛选得到的RNA“适配子”对茶碱的亲和力是对咖啡因的10 000倍,尽管咖啡因与茶碱的空间结构相差很小,只有一个甲基[21]。氨基酸、核苷酸的寡核苷酸“适配子”能将其与镜像体、突变体区别开来。同时,“适配子”也具有高亲和力的特点。这种“适配子”与蛋白质靶分子作用的解离常数可达nmol/L甚至pm ol/L的水平,与小分子靶物质作用的解离常数也可以达到μmol/L～nmol/L的水平,有的“适配子”亲和力甚至高于天然配体[22]。目前,SELEX技术已经得到不断完善,通过各种手段对“适配子”进行修饰,进一步提高了其亲和力和稳定性,加之操作过程的自动化,大大增加了SELEX技术的效率。

5 SOLEXA高通量测序技术

Solexa高通量测序技术是由剑桥大学的Solexa公司创立[23],该技术运用独特的边合成边测序技术(sequencing-by-synthesis)和可逆中止化合物染料技术(reversible terminator chemistry),提供高通量、低成本的基因组测序。是“下一代”测序技术[24],也称“深度”测序技术[25]的代表之一。

Solexa技术的原理是首先把基因组DNA从细胞中提取出来,然后将其打断成100 bp～200 bp大小的片段,在每个片段末端都加上接头(adapter),再经过PCR扩增制成DNA簇,将DNA簇加入到带有接头的芯片上,通过接头绑定在芯片上,之后加入四种荧光染料标记的核苷和聚合酶,应用边合成边测序的原理,互补的核苷与核苷酸片段的第一个碱基配对,通过聚合酶结合到引物上,多余的核苷被移走,单链DNA分子通过碱基互补配对原则进行延伸,最后,利用生物发光蛋白检测每个加入到DNA片段上碱基的信号,便可对基因组DNA进行测序[25]。

用于DNA测序的技术主要有Sanger等发明的双脱氧链末端终止法[26]以及M axam和 Gilbert发明的化学降解法[27]。当前普遍使用的测序仪,一次只能读取1 000个左右的碱基。Solexa技术可在每一张芯片获取1 G的碱基数据,速度比传统的Sanger测序要快上百倍。除了大大降低成本,Solexa技术还不受物种限制,对人类、动植物、微生物DNA都可以进行测序。同时可以检测到单拷贝分子的变化,用于SNP分析。Solexa测序技术在对基因组进行测序的同时,也可以对基因表达调控,核酸蛋白互作,以及基因功能等进行研究。

6 结语

本文介绍的几种核酸扩增新技术中,LAMP技术引物设计是关键,同时利用链置换活性的Bst酶进行环介导的扩增;HDA技术依赖解旋酶、单链结合蛋白和聚合酶这3种酶的共同作用,因此对酶的要求非常高;LAM P技术和HDA技术均是恒温条件下的核酸扩增,HDA技术甚至不需要热变性,二者已经脱离了PCR的概念。固相PCR技术是改良的PCR技术,通过化学或者生物学手段将引物固定在固相基质上,以避免引物间相互干扰,更便于产物的分离和纯化;SELEX技术利用PCR技术与寡核苷酸随机文库的结合,来进行特异序列的筛选;SOLEXA技术是PCR应用的新概念,用于基因组文库的高通量测序,是固相PCR应用的平台。

这些核酸扩增的新技术有着重要的应用价值,和各自无法比拟的优点,已经得到快速的推广和应用,随着研究者们对这些技术不断的完善,其操作过程将更加简单和规范,其效率也将进一步提高。这些核酸扩增的新技术应用于生命科学及相关的各个领域,是必然趋势,发展前景十分广阔。

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