硝唑尼特对利什曼原虫的体外药效试验*

史 赫,张瑞岩,张林波,马翠平,张西臣,刘 全*,吴永魁*

(1.吉林农业大学生命科学院,吉林长春 130118;2.解放军军事医学科学院军事兽医研究所,吉林长春 130062;3.吉林大学畜牧兽医学院,吉林长春 130062)

硝唑尼特(nitazoxanide,NTZ)化学名称2-乙酰氧基-N-(5-硝基-2-噻唑),是一种硝噻柳酸酰胺的衍生物,由Romark实验室于1976年首次报道作为一种新型抗寄生虫药物[1]。它具有广谱、耐受性好、安全剂量高、毒副作用低等优点,而且还具有抗细菌、抗病毒活性[2]。杜氏利什曼原虫 (Leishmania donovani)寄生于人体的肝、脾、骨髓和淋巴结等细胞内,虫体圆形或卵圆形,它能引起黑热病,又名黑热病原虫[3]。传统的治疗药物包括五价锑类复合物、两性霉素B、喷他脒等,但是随着五价锑类药物的耐药现象日趋增强,治疗效果不断下降,两性霉素B影响肾功能也会产生大量的副作用,而喷他脒会导致糖代谢紊乱等[4]。应用不同浓度的硝唑尼特对体外培养的杜氏利什曼原虫前鞭毛体进行试验,以考察硝唑尼特对杜氏利什曼原虫的抑杀效果。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 杜氏利什曼原虫 杜氏利什曼原虫采自四川省(编号 sc10)。

1.1.2 药物 硝唑尼特为黄色粉末,由青岛康地恩药业有限公司生产(批号20080420)。

1.2 方法

将体外培养处于对数生长期的利氏曼原虫离心回收,用白细胞血球计数板对虫体计数,用M 199培养液稀释至5×106个/mL后接种到96孔板中,每个孔190μL,试验共分8组,每组12个孔。分别将6.25、12.5、25、50、100 μg/mL 和200 μg/mL 的硝唑尼特接种到含有利氏曼原虫的96孔板中,每孔10μL,溶剂对照组加入等量的DMSO溶剂,阳性对照组加入3μg/mL的两性霉素B 10μL,空白对照组不做任何处理。分别于培养48 h和72 h时在显微镜下观察虫体运动及形态变化,试验重复3次。

1.2.1 原虫培养 虫体前鞭毛体在NNN培养基中传代保种,扩大培养时转入含100 mL/L小牛血清的M 199培养基中培养,孵育温度为28℃。

1.2.2 试验分组 试验设 6.25、12.5、25 、50、100μg/mL和200μg/mL 6个浓度组;溶剂为DMSO(与培养基的体积比为0.1%);阳性对照物两性霉素B为宝生物工程(大连)有限公司产品,用时配成3μg/mL的水溶液。

1.2.3 结果判定 肉眼观察培养基颜色变化和虫体鞭毛活动度;光镜下观察鞭毛体的形态,并以白细胞计数板计数计算增殖抑制率;姬姆萨染色观察鞭毛体大小和形态。

2 结果

2.1 培养基颜色及虫体变化

虫体培养 48 h和 72 h后,试验组(50、100、200μg/mL)培养基颜色仍为红色,试验组(6.25、12.5、25)培养基颜色变为淡红色,溶剂对照和空白对照组颜色变为淡红色至黄色。镜下观察,试验组虫体鞭毛活动较弱或几乎不动,虫体大部分不完整,而空白对照组和DMSO对照组虫体呈长梭形,运动活跃,显示不同浓度硝唑尼特对虫体呈现明显抑制作用。

2.2 计数

随着硝唑尼特浓度的升高和培养时间的增长,杜氏利什曼原虫数量下降(图1)。培养48 h时,试验组 6 个浓度(6.25 、12.5 、25、50、100、200 μg/mL)对虫体的抑制率分别为28.1%、43.8%、53.1%、68.8%、87.2%和96.9%,72 h时,试验组6个浓度对虫体的抑制率分别为31.2%、45.9%、57.1%、73.6%、90.5%和100%,DMSO对照组对虫体的抑制较弱,48 h和72 h分别为1.28%和1.36%,两性霉素B对虫体抑制率为100%。

图1 不同浓度硝唑尼特对利什曼原虫的抑制作用Fig.1 The inhibition effect of differen t concentrations of nitazoxanide on Leishmania donovani

2.3 染色观察

姬姆萨染色后,可见试验组虫体变形,核、动基体不完整,细胞质内有空泡,鞭毛脱落,空白对照组和DMSO对照组培养基变黄,虫体运动活跃,大部分呈长梭形核、动基体、胞膜及鞭毛清晰、完整(图2)。

3 讨论

杜氏利什曼原虫是一种专营寄生生活的单细胞低等真核生物,其生活史包括寄生于媒介昆虫白蛉消化道内的前鞭毛体期和寄生于脊椎动物单核巨噬细胞内的无鞭毛体期,能引起严重危害人类健康的内脏利什曼病[5],该病分布80多个国家,世界卫生组织报道目前患者数超过1 500万,每年新发病例为50多万[6]。传统用药都有一定的局限性。硝唑尼特是美国药品和食品监督管理局批准的第1个用于治疗隐孢子虫属的药物,是四十年来发现的第一个治疗贾第虫属的新药[7],该药给药方式为口服干悬剂,服用方便,体内最大安全剂量可达5 g/kg[8]。但是,至今未见将该药用于利什曼原虫的报道。

图2 药物对虫体形态的影响(1 000×)Fig.2 Effects of the nitazoxanide on parasite morphology(1000×)

体外培养的杜氏利什曼原虫经不同浓度的硝唑尼特作用后培养基颜色未变,说明试验组虫体减少。药物先使虫体变形,活动度下降,随药物浓度的增加、作用时间增长,虫体活动度逐渐下降直至死亡。姬姆萨染色发现虫体的核、动基体不完整以至消失,最终虫体变成碎片,表明硝唑尼特对离体杜氏利什曼原虫有较强的体外抑制作用。

硝唑尼特作用机制之一是抑制丙酮酸盐:铁氧还蛋白氧化还原酶(PFOR)参与的酶依赖性电子转移作用,此作用对于厌氧能量代谢来说是必不可少的[9]。硝唑尼特对杜氏利什曼原虫的抑杀作用是否与该机制有关尚需进一步研究。

[1]张可煜,王国友,薛飞群.抗寄生虫新药硝唑尼特研究进展[J].兽医导刊,2007(12):30-31.

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