深圳地区HIV/AIDS患者口腔真菌感染状况及其耐药性分析

葛风华

(南方医科大学2008级在职硕士, 广东 广州 510515)

AIDS患者人群的特殊性,有研究称,口腔真菌感染的种类和耐药性存在个体差异[1,2],其中念珠菌较多见,发病率约为20.6%-56%[3,4]。目前国内外尚无更多涉及口腔真菌感染方面的大样本、系统性研究,国外相关的报道也较少。因此,了解HIV/AIDS患者真菌感染、耐药状况,及其对抗病毒(HIV)治疗的影响,对降低艾滋病临床漏诊率,改善患者生存质量,提高临床合理用药水平具有重要意义。本文旨在获得深圳地区HIV/AIDS患者口腔真菌感染状况的第一手资料,包括菌种分布及耐药情况等,为政府决策提供科学依据,同时探讨HIV/AIDS患者免疫状态、真菌感染与抗病毒治疗之间内在联系,为患者提供更安全合理的临床用药指导打基础。

1 资料与方法

1.1 一般资料:用咽拭子法收集 2009年12月至2010年11月深圳市第三人民医院(东湖医院)门诊就诊确诊的AIDS患者200例,其中男性129例,女性71例,年龄21-76岁,平均43.5岁,取所有患者口腔分泌物为研究标本,均为初次采样,且未接受抗真菌、抗病毒治疗,排除严重肝肾功能、心肺功能障碍。

1.2 方法:咽拭子法取有相关症状患者的口腔分泌物,采用10%KOH悬滴法检查,在直接镜检下找到孢子或菌丝,临床初步诊断为口腔真菌感染患者,用无菌棉签取其分泌物,置无菌试管立即作培养;镜检下未找到孢子和菌丝,但临床高度可疑者,亦用无菌棉签取其分泌物,置无菌试管作培养,记录患者性别,年龄,以及既往相关病史及用药史,有无频繁使用抗生素等。

1.3 试剂和仪器

1.3.1 主要试剂:由法国梅里埃提供的沙氏培养基、ATB fungus试剂盒(含6种抗真菌剂:5-氟胞嘧啶,两性霉素B,制霉菌素,咪康唑,益康唑,酮康唑)、标准质控菌株采用ATCC22019近平滑念珠菌,对所测试的6种抗真菌药物均敏感,VIT EK YBC生化卡;主要仪器法国梅里埃提供的VITEK自动微生物检测仪以及培养箱。

1.4 研究方法

1.4.1 真菌的培养、鉴定:①菌液的制备:将分泌物接种于氯霉素沙氏琼脂平板上,30℃培养24-72h,若未见真菌菌落生长则继续培养至7d;②生长菌落经分纯后,选取直径2-3mm的3至4个独立菌落混悬于0.45%盐水中,用电子比浊器量度,使其浓度为2 Mc Farland;③真菌的鉴定:用VITEK YBC卡鉴定(鉴定值＞0.90),(将制备的菌液充填鉴定卡,平放在30℃的培养箱内24h后,放入AMS培养/读数箱,读数器显示结果;若未有最终结果,将鉴定卡再次平放在30℃的培养箱内24h后,放入AMS培养/读数箱,读数器显示最终结果。)

1.4.2 药敏测试:采用法国生物梅里埃公司的ATB FUNGUS药敏测试盒:①取100μ L上述含菌混悬液加于ATB F培养基中混匀,以微量加样器加此液体于5-氟胞嘧啶的10孔及其前后各4个生长对照孔中,每孔135μ L;②取无菌缓冲液50μ L加入剩余的含菌培养基中,混匀,调整 pH。再将后者接种于余下12个药物孔及4个对照孔中,每孔亦为135μ L;③盖上塑料盖放30℃孵育 24-48h。24h、48h各观察1次,各抗真菌剂的含量及结果判定标准按ATB fungus操作指南进行。当生长对照各孔生长良好,而低浓度及高浓度药物作用下生长完全受抑制,肉眼观察无浑浊判断为敏感;低浓度药物作用下生长,高浓度药物作用下不生长判断为中敏;低浓度及高浓度药物作用下均生长,肉眼观察浑浊,判断为耐药。

1.4.3 抑菌圈标准判读:5-氟胞嘧啶,咪康唑,益康唑,酮康唑,敏感(S)≥20mm,中介(I)12-19mm,耐药≤11mm;两性霉素B,制霉菌素,敏感(S)≥15mm,中介(I)10-14mm,耐药不形成抑菌圈。

2 结 果

2.1 HIV/AIDS患者中口腔真菌的感染状况:本组患者200例,分离到76例,阳性率为38%,其中白色念珠菌64例,占84.2%,马尔尼非青霉菌5例,占6.6%,黑曲霉菌2例,占2.6%,圆弧青霉菌、桔青霉菌、暗色丝孢菌、酵母菌、热带念珠菌以及克柔念珠菌各1例,占1.3%。

2.2 真菌菌种耐药分析:白色念珠菌对5-氟胞嘧啶、两性霉素B和制霉菌素效果较好,酵母菌对咪康唑和酮康唑耐药,咪康唑与益康唑对黑曲霉菌效果较差,马尔尼非青霉菌咪康唑、益康唑、酮康唑和两性霉素B均未见耐药,圆弧青霉菌、桔青霉菌对所选六种药物均敏感,热带念珠菌对咪康唑和益康唑耐药,克柔念珠菌对咪康唑耐药。

表1 各种检出真菌耐药率分布 n(%)

2.3 抗真菌药物耐药率:两性霉素B为1例,占1.4%,酮康唑为2例,占2.8%,5-氟胞嘧啶为3例,占3.9%,制霉菌素为 3例,占4.1%,咪康唑为9例,占12.1%,益康唑为52例,占70.3%。

3 讨 论

近年来,由于广谱抗生素的大量使用引起菌群失调、二重感染,以及免疫抑制剂的使用、抗肿瘤药物长期的应用等因素,特别是艾滋病、吸毒者等人群的扩大,使真菌感染的机会大大增加[5]。在临床上,由于患者长期服药,依从性差,以及抗真菌药的不规范使用等因素,使得临床耐药真菌菌株亦不断增加[6],耐药机理日趋多样化,顽固、重复感染的病例增多。目前,由条件致病菌导致的真菌感染已成为AIDS患者最常见、比例最大的机会性感染[7],同时也是其最重要的致死原因之一。调查表明,艾滋病患者合并真菌感染不仅已有耐药现象存在,部分抗真菌药物还可能影响艾滋病患者的抗HIV病毒治疗,因此成为治疗上的一大难题[8]。

口腔真菌的感染是AIDS患者最早出现的临床体征之一,也是早期发现和诊断AIDS的重要线索[9]。其中以念珠菌感染居多,又以白色念珠菌常见,根据以往经验我们将HIV/AIDS患者口腔白色念珠菌感染分为:假膜型、颗粒型、红斑型、口角炎型4型。本研究发现白色念珠菌者64例,占84.2%,其次马尔尼非青霉菌也较常见,主要影响患者呼吸以及单核网状内皮系统,主要在东南亚以及我国南部流行,感染者以青壮年居多,治疗上首选两性霉素B和酮康唑[10]。其余以少见机会致病菌多见,在治疗上两性霉素B体外抗真菌活性最强,但其肾毒性限制了它的临床使用,建议用氟康唑和氟胞嘧啶联合治疗以杀灭氟康唑耐药株,以伊曲康唑代替氟康唑治疗也是一个好的选择[11]。向黎研究表明在临床治疗中选用敏感性抗真菌药物的2联用药,主要是提高其抗真菌药物的活性,起到协同作用,避免诱导耐药株产生。随着我国对艾滋病防治的日益重视和投入逐年加大,部分艾滋病患者出现真菌感染比例较高的省份(如广西),已决定开始为艾滋病感染者提供免费的抗真菌治疗药物(包括目前最常用的伊曲康唑胶囊、氟康唑片等)。

初步估计,每名获准的患者一年需要投入上万元,而据国家卫生部统计,截止2007年底,全国已有约70万HIV/AIDS患者,这个政策一旦推广,涉及金额将十分庞大。因此,HIV/AIDS患者的真菌感染、耐药基线水平,以及如何选择抗真菌药物种类的问题,还事关政府卫生经济管理决策的重大研究。本研究以临床疑似合并口腔真菌机会性感染的HIV/AIDS患者为调查对象,对其分离的真菌作菌种及抗真菌药物的敏感性分析,了解目前各菌种在致病真菌中所占比例,及其对抗真菌药物的敏感程度是否有变化,为临床提供用药指导,并为进一步作真菌耐药菌株基因型分析,从分子水平研究耐药机理奠定基础。

[1]Vandenbossche I,Vaneechoutte M,Vendevenne M,et al.Susceptibility testing of fluconazole by the NCCLS broth mairodilution method,E-test,and disk diffusion for application in the routine labratory[ J].Clin Microbiol,2002,40(3):211-214.

[2]吴岚,周曾同,唐国瑶.口腔念珠菌基因型和扁平苔藓的关系[J].2004,13(6):544-548.

[3]Khongkunthian P,et al.Oral Pathol Med,2001,30(4):220-223.

[4]Lee CC,et al.Ann Acad Med Singapore,1997,26(6):83-85.

[5]陈建钢,钟志华,吴小燕,等.武汉大学学报,2003,24(1):83-85.

[6]Alexander BD,Perfect JR.Anrifungal resisitance trends towards the year 2002[J].Drugs,1997,54(5):657.

[7]雷华,李永绮,游晶.传染病信息,2007,20(2):122.

[8]李多,李庆福.临床口腔医学杂志,2007,23(10):633.

[9]刘晓松,刘宏伟,郭子杰,等.中华口腔医学杂志,2005,40(3):211-214.

[10]马沛卿,郎振为,沈冰,等.艾滋病合并马尔尼非青霉菌感染2例的病理特点[J].中华传染病杂志,2006,24(5):338-341.

[11]Antoniadou A,Torres HA,Lewis RE,et al.Candidemia in a tertiary care cancer center:in vitro susceptibility and its association with outcome of initial antifungal therapy[J].Medicine,analytical reviews of general medicine neurology psychiatry dermatology and pediatries,2003,82(5):309-321.