硫素营养水平对大豆籽粒OAS-TL表达的影响

马淑梅，刘丽君，孙聪姝，董守坤，祖 伟

（东北农业大学农学院，哈尔滨 150030）

硫是植物生长所必需的矿质营养元素，同碳、氮营养一样，在植物代谢和生长发育过程中起着重要作用。大豆籽粒富含蛋白质，但含硫氨基酸含量很低，是大豆蛋白质营养价值的限制因子。研究大豆硫素代谢的关键酶，对深入了解大豆品质形成影响的关键位点，提高大豆含硫氨基酸含量具有重要意义。

半胱氨酸（Cys）作为硫代谢途径中最初的还原硫化合物，是蛋氨酸、谷胱苷肽、辅基、维生素、硫脂等硫衍生物的合成前体，是维持蛋白质结构和活性的必要因素，体现了硫素的生理功能。氧乙酰丝氨酸（硫醇）裂解酶（O-acetyl-L-serine（thiol）-lyase，OAS-TL）和丝氨酸乙酰转移酶（Serine acetyltransferase，SAT）以双酶复合体的形式存在，通过构象变化共同催化OAS与S2+合成半胱氨酸[1-2]。其中，游离型OAS-TL起催化半胱氨酸合成的作用，该反应将硫代谢和氮代谢联系起来，受硫素营养调控[3]。一般情况下，生物体会根据硫酸盐还原途径中硫化物的生成量来调节OAS的合成，并最终对整个硫素吸收和同化进行调控。在高等植物中，已经克隆到一族OAS-TL酶的cDNA，并且在大肠杆菌中进行了功能表达。在A.thaliana中发现了4个编码OAS-TL的基因，分别命名为（oasA1、oasA2、oasB和oasC），分别编码胞质型、线粒体型和叶绿体型OAS-TL[4-5]。目前，大部分关于OAS-TL活性及表达的研究都是外界条件短期内对室内培育植株刺激的影响，而室外盆栽种植条件下鼓粒期籽粒OASTL的研究少见报道，本试验拟通过对大豆氧乙酰丝氨酸（硫醇）裂解酶的克隆及在硫素营养下表达的探索，为进一步研究硫素代谢同化调控机制提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 植物材料

盆栽试验品种选用东北春大豆品种东农46（高油型）和黑农35（高蛋白型）。

1.2 方法

1.2.1 大豆硫素营养处理

采用盆栽试验，利用规格35 cm×15 cm的米氏盆，装15 kg·盆-1土与砂的混合物（重量比1：1）以降低土壤基础肥力，测定有效硫含量为9.3 mg·kg-1，在临界值（16 mg·kg-1）以下，保证施硫效果。黑农35和东农46分别设3个施硫水平：低硫（S0）、中硫（S20）、高硫（S80），施入纯硫量分别为 0、0.02、0.08 g·kg-1土；氮肥施入量为纯氮 50 kg·hm-2；磷肥施入量为 75 kg·hm-2；钾肥施入量为 50 kg·hm-2。硫肥采用硫磺粉；氮肥采用尿素；磷肥采用重过磷酸钙；钾肥采用氯化钾，肥料作为基肥播种前一个月施入。硫磺粉经过氧化后，测得S20处理有效硫含量为19.7 mg·kg-1，S80处理有效硫含量为77.5 mg·kg-1。每盆播种5粒，定苗3株。每个处理重复40次。自鼓粒期开始取籽粒，每隔7 d取1次，共取4次。取样时将每5株大豆10节和11节上的豆荚取下，拨开豆荚将籽粒取出，用氯仿擦拭混合后包于锡纸并存放于液氮中，最后转移至超低温冰箱。

1.2.2 OAS-TL活性测定

称取籽粒0.5 g，置于预先冷冻过的研钵中，加入5 mL提取液，冰浴下研磨至匀浆，倒入离心管，4℃下14 000 r·min-1，离心 15 min。取上清 100 μL，加入 1.0 mL 反应液（100 mmol·L-1的 Tris-HCl，pH 8.0，内含 20 mmol·L-1的 OAS，1 mmol·L-1的Na2S），26℃水浴下反应10 min，终止后加入2.5 mL茚三酮溶液（250 mg茚三酮溶于10 mL冰醋酸：浓盐酸（3：2）的溶液）中，沸水浴10 min后迅速冷却，加入2 mL冷冻过的100%的乙醇并混合均匀，546 nm波长测定吸光值。以半胱氨酸做标准曲线，酶活单位为μmol·g-1FW·min-1，表示单位时间内每1 g鲜叶片产生的半胱氨酸量。每个样品3个平行样，3次重复[6]。

1.2.3 东农46籽粒总mRNA的提取及反转录合成cDNA

按照Trizol Reagent Invitrogen的试剂盒说明书提取东农46籽粒总RNA，采用紫外分光光度计测定样品OD260/280值在1.8～2.0之间，用 1.5%琼脂糖电泳检测RNA无明显降解后进行反转录。取RNA 2 μg按Prime ScriptTMRT-PCR Kit试剂盒的操作方法，两步法完成反转录，获得cDNA模板，-20℃保存，用于PCR扩增。

1.2.4 OAS-TL的同源克隆

利用Primer Primer 5.0软件，根据GenBank提供的大豆OAS-TL基因序列（Accession No.AF452 451）设计特异引物。上游引物OAS-TL-F：5′GCT TTGTAGTGAGCAGAT3′，下游引物 OAS-TL-R：5′ATCTGCTCACTACAAAGC3′，在 NCBI网站上进行Blast以保证引物的专一性后，由上海生工合成。PCR反应总体积为 20 μL，含10×酶反应缓冲液2μL，dNTP（2.5 mmol·L-1）0.5 μL，引物（10mmol·L-1）各 0.5 μL，反转录所得的 cDNA 0.5 μL，Taq 酶（5 U·μL-1）0.2 μL。反应程序为 94 ℃预变性5 min，94℃变性30 s，54℃退火30 s，72℃延伸90 s，共35个循环，72℃终延伸6 min。扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳分离后，用DNA凝胶回收试剂盒TaKaRa DNA Fragment Purification Kit Ver.2.0将目的片段回收纯化，连接于克隆载体pMD18-T Vector（TaKaRa）上，质粒热激转化已制备好的感受态E.coli DH5α，通过蓝白斑筛选和菌落PCR鉴定，将阳性菌落于37℃振荡培养过夜，次日收集菌体，送至上海生物工程公司测序。将测序结果拼接，得到序列与GenBank数据库进行生物信息学分析，采用DNAMAN6.0软件对核酸序列分析及进化分析。

1.2.5 大豆籽粒RNA提取及反转录

方法同1.2.3，经紫外/可见光分光光度计将各处理RNA含量调到一致。

1.2.6 半定量RT-PCR

参照克隆得到的大豆OAS-TL cDNA序列进行半定量引物设计。上游引物OAS-TL-1-F：5′TTTG TTTCTGGGATAGGCACT3′，下游引物OAS-TL-1-R：5′CTCAAATAGCACGGAGGACAG3′，预期长度470 bp左右；内参参照大豆核糖体18S基因。上游引物 18S-F：5′AACCCCGACTTCTGGAAG3′，下游引物 18S-R：5′AACGGAATTAACCAGACAAA3′，预期长度1 100 bp左右。采用上述RCR体系，分别采用25、28和31个循环，确定指数扩增期，最后确定28个循环为宜。扩增18S基因，调整cDNA加入量，使扩增出来的条带在琼脂凝胶上看起来亮度一致。在28个循环条件下，扩增目的基因OAS-TL。取PCR产物2 μL，DNA marker 2 μL，1.5%琼脂凝胶电泳检测后凝胶成像系统分析结果。

2 结果与分析

2.1 硫素营养对大豆籽粒OAS-TL的活性影响

自鼓粒期起每隔7 d取样，研究硫素营养对大豆籽粒OAS-TL活性的影响，结果见图1。鼓粒期大豆籽粒OAS-TL随生育进程推进活性持续下降，高油品种东农46活性总体上大于高蛋白品种黑农35，硫素营养在第7、14天作用效果显著，不同施硫处理间差异明显。第7天时，S20处理显著增加OAS-TL活性，东农46和黑农35 S20处理分别比对照高21%和15%，S80增活效果不明显；在第14天，东农46和黑农35，S20处理分别比对照高31%和30%，S80增活效果不明显；第21天和第28天时各处理活性差异不大。

2.2 大豆OAS-TL基因序列分析

2.2.1 大豆OAS-TL基因的扩增结果

以提取的东农46籽粒总RNA为模板（见图2），反转录合成cDNA。以cDNA为模板，用克隆引物进行RT-PCR扩增，PCR产物经凝胶电泳检测见图3。从电泳结果推测，克隆片段长度为1 000 bp左右。

2.2.2 目的片段序列测定及同源性分析

扩增产物经琼脂凝胶电泳分离后，用DNA凝胶回收试剂盒将目的片段回收纯化，连接于克隆pMD18-T Vector载体上，经PCR检测为阳性克隆后，送至上海生物工程公司测序。测序结果显示，克隆到的大豆氧乙酰丝氨酸（硫醇）裂解酶基因cDNA长度为1 059 bp，预测开放阅读框架始于第58位碱基，终于第912位碱基，共编码284个氨基酸。采用分子生物学信息分析软件DNASTAR，预测该蛋白相对分子质量为28.49，等电点为5.45。OAS-TL类属于一大类以磷酸吡哆醛为辅基的超基因家族（PALP）。由图3可知，大豆OAS-TL氨基酸序列具有该保守功能区，N端存在保守结构域PXXSVKDR，其中赖氨酸（Lysine）是磷酸吡哆醛的结合位点（图4中用括号已标注）。将得到的核酸序列登录到NCBI网站上，用Blastn程序进行序列的同源性检索发现东农46的OAS-TL核酸序列与其他物种同源性很高，与箭舌豌豆（Vicia sativa）、三叶草（Trifolium subterraneum）、鹰嘴豆（Cicer arietinum）、野生大豆（Glycine soja）亲缘很近。

图4 OAS-TL cDNA核酸序列和相应的氨基酸序列Fig.4 Sequence of nucleic acids and deduced amino acids sequence of OAS-TL cDNA

2.3 硫素营养对大豆OAS-TL基因的表达影响

取东农46和黑农35各处理籽粒cDNA经18S引物扩增调整模板浓度一致后，再以克隆到的大豆OAS-TL为模板设计特异引物，进行半定量PCR扩增及检测。检测结果见图5、6。可知，18S表达稳定，可以作为对照研究OAS-TL的表达情况。OAS-TL基因表达受发育的调控，其稳定态mRNA表达在籽粒发育早期表达较强，随成熟逐渐降低。不同处理下OAS-TL的表达有差异。在第7天时，东农46和黑农 35都表现为S20、S80处理高于对照处理，硫素长期匮乏导致OAS-TL的mRNA下调表达；在第14天时，黑农35 S20处理显著高于对照和S80处理；东农46的S20、S80处理都高于对照，S80下mRNA最强。籽粒成熟后期硫缺乏效果解除。

3 讨论与结论

氧乙酰丝氨酸（硫醇）裂解酶（OAS-TL）是半胱氨酸合成最后一步的关键酶，在半胱氨酸的合成调节中占据核心地位。本研究以东农46为材料，设计特异性引物，获得一个编码OAS-TL基因的cDNA序列，全长1 059 bp，ORF长855 bp，编码284个氨基酸。该酶基因类属于一类以磷酸吡哆醛为辅基的超基因家族（PALP），N端存在保守结构域PXXSVKDR，聚类分析表明，大豆OAS-TL基因与其他植物该基因高度同源。本研究另外采用2个品种黑农35和东农46，设置了3个硫水平，研究硫素营养对OAS-TL表达的影响。结果表明：①2个品种籽粒OAS-TL活性表现为S20高于S0和S80处理；鼓粒前期施硫效果大于后期。②RT-PCR显示OAS-TL稳定态mRNA表达在籽粒发育早期表达较强且处理间差异明显，发育后期表达水平逐渐降低。不同硫素处理间OAS-TL的表达有差异，总体上S20上调表达明显。

按照植物硫营养调控中的需求所驱动的（Demand-driven）原理，硫供应在正常水平下，硫同化途径受到抑制，当植物处于需求状态且土壤环境中硫营养供给源不足时，上调硫营养吸收转运与同化代谢水平，既OAS-TL基因表达应上调以促进代谢平衡。但在本研究中，硫素匮乏降低了两种类型大豆籽粒鼓粒初期OAS-TL的活性及稳定态mRNA的表达，这与之前的假说有很大的不同。原因可能是大豆植株缺硫的状态经过苗期、花期，一直持续到鼓粒期，长期的硫素匮乏抑制了硫代谢网络在植物细胞内多基因和多通路的调节机制，降低了OAS-TL的活性与表达，本研究与Hirai等研究结果一致[7]。

硫素代谢受发育的调控，即在较嫩的籽粒中mRNA表达高于成熟的籽粒，硫素缺乏和过量对各基因mRNA表达的影响在此时明显，而随着籽粒的成熟，mRNA表达下降，伴随应答反应消失[8-9]。本研究中OAS-TL活性及基因表达在籽粒发育前期较强，后期逐渐下降，这种表达的发育调控模式显示硫同化主要发生在生长活跃的组织中，需要大量的半胱氨酸和甲硫氨酸来进行蛋白质的合成，而成熟的籽粒中积累的硫酸根在后期的发育中起到了缓冲的作用。

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