常温高效纤维素分解菌的筛选

马怀良，郭文学，柴军红

（1.牡丹江师范学院生物系，黑龙江 牡丹江 157012；2.牡丹江市绿珠果蔬有限公司，黑龙江 牡丹江 157000）

我国的纤维素资源非常丰富，仅农作物秸秆一项，每年可达6～10亿t，但由于天然纤维素的复杂和难降解，人们对它的开发和利用十分有限[1]。筛选高效纤维素分解菌株是利用纤维素类资源的关键[2]，在食品、饲料、医药、化工、能源等领域具有广阔的应用前景[3]。但目前应用的纤维素分解菌普遍存在酶活力较低，分解速度慢的问题[4-5]，因此筛选高效纤维素分解菌具有重要的意义。

本试验从长期堆放稻草的土壤中分离出数纤维素分解菌，并对其纤维素酶活力进行了测定，以期为纤维素酶制剂生产及利用纤维素资源提供优良菌株。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 滤纸处理

滤纸（巧生牌中速定量滤纸）用1%醋酸浸泡24 h，用碘液检查确定无淀粉后，2%苏打水冲洗至中性，晾干，剪成1 cm×6 cm小条待用。

1.1.2 样品采集

从长期堆放稻草的土壤中，取地下5～25 cm处的样品装入预先灭过菌的三角瓶中，包扎好后取回待用。

1.2 培养基

Hutchison液体培养基[6]：KH2PO41 g，FeCl30.01 g，MgSO4·7H2O 0.3 g，NaNO32.5 g，CaCl20.1 g，NaCl 0.1 g，H2O 1 000 mL，pH 7.2～7.4。将液体培养基分装于150 mL三角瓶内，每瓶50 mL，每瓶加入10张滤纸条，121℃灭菌20 min后备用。羧甲基纤维素培养基（CMC）[7]：CMC-Na 15 g，NH4NO31 g，酵母膏1 g， MgSO4·7H2O 0.5 g，KH2PO41 g，琼脂 20 g，H2O 1 000 mL。121 ℃灭菌20 min后备用。

1.3 菌种富集、分离、纯化

将10 g样品置于250 mL装有小玻璃珠的三角瓶中，加入100 mL无菌水，120 r·min-1振荡10 min。取1 mL悬液加入到盛有Hutchison液体培养基的三角瓶中，28℃静置培养。待滤纸崩解以后，120 r·min-1振荡10 min，再转接到新鲜的培养液中，接种量为10%，如此转接数代，淘汰失去分解能力和不稳定的培养物[4]。观察滤纸条断裂情况，在滤纸条断裂处挑取培养物在羧甲基纤维素培养基平板上划线分离，28℃培养获得单菌落。将单菌落反复划线纯化，结合显微镜镜检，直至纯化得到纯菌株。

1.4 菌株发酵产酶试验

将筛选的菌株在羧甲基纤维素培养基试管斜面上，28℃活化3 d。将5 mL无菌水滴加到试管斜面中，振荡，制备成菌悬液。吸取菌悬液1 mL接入盛有Hutchison液体培养基的三角瓶中，28℃，150 r·min-1的恒温水浴振荡器培养7 d。

1.5 纤维素酶活力的测定

1.5.1 粗酶液的制备

取培养7 d的发酵液，于4℃、3 000 r·min-1离心15 min，取上清液，即为粗酶液[8]。

1.5.2 标准曲线的绘制、C1酶活力、羧甲基纤维素酶（CMCase）活力、滤纸酶活力（FPA）测定[9]。

在上述条件下，以国际单位为依据，定义每分钟催化纤维素水解生成1 μmol葡萄糖的酶量为一个酶活力单位（IU），其计算公式为[10]：

1.6 数据处理

采用SPSS 13.0软件进行方差分析，显著性分析采用LSD法。

1.7 菌种鉴定

参照文献[11]。

2 结果与分析

2.1 纤维素分解菌的筛选及酶活力测定

从土壤中分离出霉菌11株，分别命名NM1～NM11；放线菌1株，命名为NA。将12株纤维素分解菌接入Hutchison液体培养基，培养7 d后，测定纤维素酶活力。方差分析结果见表1。菌株间C1酶活力、CMC酶活力、滤纸酶活力差异极显著。

表1 纤维素酶活力方差分析Table 1 Cellulase activity analysis of variance in different strains

由表2可知，12株纤维素分解菌C1酶活力、CMC酶活力与FPA差异较大，其中NM5的C1酶活力、CMC酶活力、FPA均最高，分解纤维素的能力最强。纤维素酶是一组复合酶系，由CMC酶活力、C1酶和β-葡萄糖苷三类组分酶组成，微生物分解纤维素的能力取决于这三类组分酶的协同作用。微生物产生的纤维素酶系是否齐全，不同的纤维素底物诱导效应，营养基质，培养条件等因素使三类组分酶的含量、比例和活性不同，影响三类组分酶的协同作用，导致微生物对纤维素分解能力差异较大。另外，不同微生物产生的纤维素酶酶促反应具有不同的最适pH和温度。而在测定纤维素酶活时，pH和温度是既定的，在此条件下，测定不同微生物产生的纤维素酶活力有高有低，这也是微生物分解纤维素能力差异较大的一个原因。

表2 纤维素酶活力显著性分析Table 2 Significant difference analysis of cellulase activity in different strains

2.2 菌株NM5鉴定

菌落特征：将NM5接种至PDA培养基上，菌落开始时为白色，棉絮状，后从菌落中央产生绿色孢子，中央变成绿色，菌落周围有白色菌丝的生长带。最后菌落大部分变成绿色。形态特征：分生孢子梗从菌丝的侧枝上生出，直立，分枝，小枝对生，顶端不膨大，上生分生孢子团，分生孢子球形，无色。

根据NM5的菌落特征和形态特征，同时参见文献[11]，将NM5初步鉴定为木霉菌属（Trichoderma）。结果见图版Ⅰ。

图版I NM5的菌落特征和形态特征Plate I Colonial characteristic and morphological characteristic of strain NM5

3 讨论

目前国内外所选育出来的优良纤维素分解菌几乎都是木霉属菌株[12]，特别是里氏木霉（T.reesei）[13]。因此可根据木霉的生长特性、营养需求等因素优化培养基进行定向筛选，以获得分解纤维素更强的木霉菌株。

目前，我国应用于生产纤维素酶的菌株的FPA为 100 μmol·g－1·h－1左右[5]，而本试验筛选的木霉属菌株NM5采用Hutchison液体培养基发酵，FPA可达 80.61 μmol·g－1·h－1，如对其进行诱变或产酶条件优化，可进一步提高纤维素酶活力，为生产提供优良菌株。

在测定纤维素酶活力时，常以CMC酶活力和FPA表示。由于羧甲基纤维素钠（CMC-Na）是可溶性的纤维素，而天然的纤维素结构复杂，不溶于水，因此CMC酶活力并不能真实地反映菌株分解纤维素的能力。而滤纸是聚合度和结晶度都居中等的天然纤维材料，PFA可表征菌株分解纤维素的能力及其纤维素酶系的协同作用[14]，因此测定纤维素酶活力应以FPA为主。不同厂家生产的滤纸质量参差不齐，测定的FPA可比性较差，不利于评价各菌株间分解纤维素的能力差异，因此有必要建立测定FPA专用的、严格的滤纸质量标准。

4 结论

用Hutchison液体培养基和羧甲基纤维素培养基平板对采集的样品进行初筛，筛选出12株常温纤维素分解菌，并结合Hutchison液体培养基发酵试验，从中筛选出1株分解纤维素能力较强的霉菌NM5，初步鉴定为木霉菌属（Trichoderma），其C1酶活力、CMC酶活力、FPA分别为0.0170、0.7174、1.3435 IU·mL-1，具有较强的应用价值。

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[4]孙宝魁,王东伟.高效稳定纤维素分解混合菌群的筛选及分解特性研究[J].环境科学与管理,2008,33(9)∶116-119.

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[7]张建强,李亚澜,李勇.纤维素降解菌的分离鉴定及固态发酵条件[J].西南交通大学学报,2006,41(4)∶442-446.

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[14]李振红,陆贻通.高效纤维素降解菌的筛选[J].环境污染与防治,2003,25(3)∶133-135.