灵芝孢子油检测标准与其抗肿瘤活性的关系*

李向敏 ，谢意珍 ，2**，潘鸿辉 ，2，简伟明 ，罗 彪 ，李森柱 ，2， 张 智 ，2

（1.广东粤微食用菌技术有限公司，广东 广州 510663；2.广东省微生物研究所，广东 广州 510070）

灵芝（Ganoderma lucidum）是中药宝库中的珍品[1]。灵芝孢子油是由灵芝孢子粉经CO2超临界萃取而来的灵芝孢子粉中脂溶性物质，主要含有三萜类、甾醇类、脂肪及脂肪酸等成分[2，3]。功效研究表明其具有增强细胞免疫及增强NK细胞活性等降血脂[4]、免疫调节功能，并具有护肝[5]及直接抑杀肿瘤干细胞的作用[4，6]。

由于灵芝孢子油功效显著，价格昂贵，所以市场上相关产品的质量参差不齐，严重影响了消费者的利益。目前，业内通常采用食用油的质量监控指标即过氧化值、酸价作为孢子油的主要质量监控指标。由于孢子油所含的活性物质如三萜类大部分呈酸性，并含有多种不饱和酸，这些成分都提高了孢子油的酸价，因此酸价和过氧化值作为灵芝孢子油的质量检测指标能否体现产品质量就有待进一步研究。本研究中采用常规方法，如KOH标准滴定法测酸价、KI-I2法检测过氧化值、紫外-可见光分光光度法测总三萜，此外利用肿瘤细胞检测样品抗肿瘤活性，主要研究灵芝孢子油质量检测指标与其抗肿瘤活性之间的关系，为灵芝孢子油的质量检测和标准化提供试验依据和参数。

1 仪器与试剂

北京普析通用T6新世纪紫外-可见光光度计；Agilent LC-1200高效液相色谱仪；NIKON显微镜 TS100-F；Galaxy S二氧化碳培养箱等。

灵芝孢子油由广东省微生物研究所广东粤微食用菌技术有限公司提供。

齐墩果酸对照品 （批号 093K0961，sigma）； 乙腈（HPLC级，Merck公司产品）；Mill-Q超纯水；其他化学试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 检测和结果

2.1.1 酸价测定

参照GB/T 15689-1995。准确称取3.00 g～5.00 g混匀的灵芝孢子油，置于锥形瓶中，加入50 mL中性乙醚-乙醇混合液，振摇使油溶解；冷至室温，加入酚酞指示液2滴，以氢氧化钾标准滴定溶液滴定，至出现微红色，且0.5 min内不褪色为终点，并进行计算。

2.1.2 过氧化值测定

参照GB/T 5009.37-2003。准确称取2.50 g混匀的灵芝孢子油，置于250 mL碘瓶中，加入30 mL三氯甲烷-冰乙酸混合液，振摇使油完全溶解。加入1.00 mL饱和碘化钾溶液，紧密塞好瓶盖，并轻轻振摇0.5 min，然后在暗处放置3 min。

取出加100 mL水，摇匀，立即用硫代硫酸钠标准滴定溶液（0.0020 mol·L-1）滴定，至淡黄色时，加1 mL淀粉指示液，继续滴定至蓝色消失为终点。

取相同量三氯甲烷-冰乙酸混合液30 mL、碘化钾溶液1 mL、水100 mL，按上述方法，做试剂空白试验，并计算结果。

加入酚酞指示液2滴，以氢氧化钾标准滴定溶液滴定，至出现微红色，且0.5 min内不褪色为终点，并进行计算。

2.1.3 三萜含量测定

参照广东省地标DB44。

（1）样品处理

取灵芝孢子油0.030 g，准确至0.1 mg，置于150 mL圆底烧瓶中。加无水乙醇40 mL，70℃水浴加热，并摇动至其完全溶解。冷却至室温后用无水乙醇定容至100 mL，待测。

（2）标准曲线的制作

吸取齐墩果酸储备液（0.1 mg·mL-1）0.20 mL、0.40 mL、0.60 mL、0.80 mL、1.00 mL、1.20 mL于 25 mL具塞比色管中，常压水浴蒸干溶剂。加入新配置的5%香草醛-冰乙酸0.20 mL和高氯酸0.80 mL，摇匀。70℃水浴加热15 min，取出，冰水冷却5 min，用自来水水浴调至室温。用移液管准确移取冰乙酸5.00 mL稀释，摇匀。以试剂做空白参比，在30 min内紫外可见光光度计在545 nm处测定吸光光度值y（A）。以吸光度y为纵坐标，以三萜含量（mg）为横坐标，绘制标准曲线，求出直线回归方程为y=0.114X+0.001，并计算相关系数为0.9988。

（3） 测定

吸取待测液1.00 mL于25 mL具塞比色管中，常压水浴蒸干溶剂。加入新配置的5%香草醛-冰乙酸0.20 mL和高氯酸0.80 mL，摇匀。70℃水浴加热15 min，取出，冰水冷却5 min，用自来水水浴调至室温。用移液管准确移取冰乙酸5.00 mL稀释，摇匀。以试剂做空白参比，在30 min内紫外可见光光度计在545 nm处测定吸光光度值y（A）。通过线性回归方程算得测定用的样液中三萜类物质的质量，并依据公式计算结果。结果见表1。

（4）精密度试验

取样品溶液，在波长545 nm下，连续测6次，结果为吸光度平均值0.560，RSD值为0.00%，表明本方法的精密度良好。

（5）重复性试验

取2号样品，按照（1）和 （3）进行样品处理和测定，平行制备6份。利用紫外-可见光分光光度计在545 nm波长处测定吸光度，计算出总三萜的含量。结果该样品的总三萜平均含量为12.16%，RSD值为2.3%，表明本方法重复性良好，

（6）稳定性试验

取2号样品，按照（1）和 （3）进行样品处理和测定。利用紫外-可见光分光光度计在545 nm波长处测定吸光度，在1 h内每隔10 min测定1次，结果显示吸光度的平均值为0.5545，RSD值为0.50%，表明样品制备后在1 h内测定，稳定性良好。

（7）回收率试验

精密称取已知含量的样品4（三萜含量11.20%）0.020 g至容量瓶中，加入标准溶液2 mL起，加入乙酸乙酯溶解，并定容至刻度，摇匀。按测定方法进行制备，测定吸光度，计算，结果平均回收率95%，表明本方法具有良好的回收率。

2.1.4 样品的测定结果

以上述方法对3批样品进行测定，结果见表1。

表1 灵芝孢子油各项指标的测定结果

样品1～样品6的酸价、过氧化值、总三萜情况分别如表1所示。

2.2 灵芝孢子油体外抑制肿瘤细胞的作用和实验结果

2.2.1 样品的制备

精确称取样品于无菌离心管中，用溶剂溶解样品，配制成浓度为10%（体积比）样品。充分溶解后，过滤，转移至新的无菌离心管中， 然后将样品稀释，待用。

2.2.2 肿瘤细胞培养

MT-1和Jurkat细胞培养使用含10%灭活的胎牛血清、100 U·mL-1青霉素和100 mg·L-1链霉素DMEM培养液进行培养。将密度为1×105个·mL-1处于对数生长期的肿瘤细胞接种于96孔培养板中，每孔100 μL，试验设对照组及不同浓度给药组，每组设6个平行孔，5个梯度，置于37℃、5%CO2培养箱内培养，细胞贴壁后，加入不同浓度样品溶液共孵育。分别加入灵芝孢子油溶液1 μL、2 μL、3 μL、 4 μL、 5 μL，实验对照组只加溶剂。 加入药物后分别培养48 h。收集细胞，并利用细胞计数器计数，实验重复3次。细胞存活率（P）公式为：

P=n1/n2×100%

式中：n1为实验组n2为对照组。

2.2.3 实验结果

灵芝孢子油对肿瘤细胞抑制作用见表2和表3。

表2 灵芝孢子油对MT-1细胞生长抑制率

表3 灵芝孢子油对Jurkat细胞生长的影响

灵芝孢子油能够在很低浓度抑制MT-1和Jurkat细胞的生长，并且在一定浓度范围内呈现浓度相关。

3 小结和讨论

由试验结果发现，酸价的高低与总三萜的含量和抗肿瘤作用呈现正相关的关系，酸价越高，总三萜的含量也越高，在很低的浓度就能达到抑制肿瘤细胞生长的效果，这一实验结果与文献研究是一致的[7-9]。灵芝三萜是灵芝孢子油主要活性成分，已发现120多种，为四环三萜和五环三萜，含有多种功能基团，其中约50%的灵芝三萜类化合物为带羧基的三萜酸，故灵芝孢子油的本身决定其酸价较高。实验结果也证明了灵芝孢子油的酸价远高于国家一级食用植物油的酸价指标（1.0 mg·g-1），而且酸价越高，活性越强，故酸价作为食用油的指标引入到灵芝孢子油的品质好坏的评价是不合理的。

过氧化值同样作为食用油质量标准引入到灵芝孢子油的质量标准中。由实验结果得出，不同样品过氧化值的变化不明显。

本研究旨在通过对灵芝孢子油已有质量检测指标和活性成分进行测定，同时寻找其与抗肿瘤活性作用之间的关系，为灵芝孢子油的标准化研究提供科学依据。综上所述，酸价作为食用油的标准引入到灵芝孢子油的质量检测中，是不能够体现灵芝孢子油质量和活性效果的，总三萜的含量高低在一定程度上能够反应灵芝孢子油质量品质，为灵芝孢子油质量标准的研究和建立提供有效的试验参数。

[1]邓叔群.中国的真菌[M].北京：科学出版社，1964.

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