MMP-2、12在兔脊髓损伤中的表达及与损伤程度的相关性研究

翟文亮，陈志文，王兴盛，练克俭，周 亮

基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）是一类与神经障碍后炎症反应、伤口愈合、细胞凋亡以及其他病理过程密切相关的蛋白水解酶家族[1]，近年来在脊髓损伤，尤其是继发性脊髓损伤中的作用越来越受到学者们的关注。本实验旨在观察兔在不同时间点损伤段脊髓组织中MMP-2、12表达的变化，并对其与损伤程度的相关性进行探讨，以阐明MMPs在脊髓损伤发展过程中的作用。

1 材料和方法

1.1 主要实验试剂和仪器

Trizol（美国Gibco公司），Taq酶、RNA酶抑制剂、TBE、Loading buffer（上海捷兰生物技术有限公司），荧光定量专用Taq酶（美国Promega公司），免疫组化检测试剂盒EnVisionTM Two-step Histostaining Reagent（丹麦DAKO公司），MMP-2 rabbit多克隆抗体（武汉博士德生物技术公司）；DY-50IB型电泳仪、H6-I微型电泳槽（上海琪特分析仪器有限公司），基因扩增仪TC-96/T/H（a）（杭州大和热磁电子有限公司），荧光定量PCR仪（Applied Biosystems 7000 Real Time PCR System），凝胶成像系统GIS-2008（上海天能科技有限公司）。

1.2 实验模型与分组

健康新西兰大耳白家兔135只[福建省动物实验中心提供，合格证号为SYXK(军)2008-047]，体重2.5～3.0 kg，雌雄不拘。随机分成3组：全瘫组（A组）、不全瘫组（B组）和假手术对照组（C组），每组45只。A、B组实验动物分别以3%戊巴比妥钠30 mg/kg静脉全麻后，俯卧位固定于手术台上，备皮、消毒，以T8棘突为中心作纵形切口，长度约2 cm，向两侧推开骶棘肌，咬除T7～T8棘突、椎板，暴露脊髓8 mm×6 mm，安装自制Allen打击架，打击导管对准打击中心，并使之垂直紧贴硬脊膜，打击头径2 mm，高度4 cm。A组用重20 g（打击势能约为80 gcm）、B组用重10 g（打击势能约为40 gcm）打击致伤脊髓后关闭切口。对照组仅行椎板切除术。术后前3日青霉素20万单位/d肌注，每日2次，定时挤压下腹排尿3次/d至自主排尿恢复。

1.3 运动功能评分

分别于术前1 h，术后麻醉清醒后6 h，损伤后24 h、48 h、7 d、14 d各组家兔随机抽取7只放于开阔空间内观察动物双后肢运动功能，采用改良Tarlov评分法进行评价：0分：完全瘫痪，针刺下肢无反应；1分：完全瘫痪，针刺下肢有反应，但肢体不能活动；2分：肢体可活动，但不能站立或站立不稳；3分：可站立，但无法行走；4分：可行走数步，但不能稳定；5分：能缓慢行走，但不灵活；6分：正常行走。

1.4 标本采集和组织学观察

3 组实验动物分别于术后6 h、24 h、48 h、7 d、14 d各时间点各取5只，静脉注射麻醉后按原手术切口切开，取出距损伤中心区（对照组取假手术区）上下宽约0.5 cm、长约1.5 cm的脊髓组织，取其1/3（长约0.5 cm）以4%多聚甲醛固定，梯度酒精脱水、二甲苯透明、石蜡包埋，4 μm连续切片，苏木精—伊红染色，进行组织学观察。剩余2/3的骨髓组织（长约1.0 cm）标记后液氮冻存备用。

1.5 MMP-2免疫组织化学染色法检测

根据实验设计按不同的时间点将取出备用的脊髓组织（长约1.0 cm）置于10%中性缓冲福尔马林（pH 7.4）固定液中固定，采用辣根过氧化物酶（HRP）标记的链霉卵白素试剂盒（博士德生物工程有限公司）染色（SP法），具体步骤如下：（1）常规石蜡包埋切片；（2）石蜡切片常规脱蜡；（3）3%过氧化氢，室温反应10 min，蒸馏水漂洗2 min×3次；（4）将切片浸入0.01 mol/L枸橼酸盐缓冲液（pH 6.0），微波炉加热至沸腾后断电冷却，反复1～2次，0.01 mol/L PBS洗涤2 min × 3次；（5）加正常山羊血清封闭液，室温下孵育2 h；（6）滴加一抗MMP-2兔多克隆抗体（博士德生物工程有限公司，浓度1：100），37℃孵育过夜；（7）滴加生物素化羊抗兔 IgG，室温下反应20 min；（8）滴加HRP工作液，在室温下反应20 min，0.01 mol/L PBS洗涤5 min× 3次；（9）DAB显色，苏木素复染，中性树脂封片。阴性对照实验采用替代法，用PBS代替一抗、二抗及HRP工作液做上述操作。免疫组化检测MMP-2的表达结果判读：参照试剂盒说明记录每张切片的阳性细胞数。阳性细胞胞浆棕黄色染色，计数高倍视野内染色阳性细胞（每个标本选5张切片，在200倍光镜下随机选取6个视野，每个时间点共计30个视野），计算阳性率，以均数±标准差表示。

1.6 MMP-12 Real-Time PCR荧光定量检测

取材的时间点与MMP-2组相同。实施荧光定量PCR按照试剂盒说明操作：（1）组织总RNA提取。（2）cDNA 的合成：引物 MMP-12 Loaded-504序列5'-TTT TGA TGG CAG AGG TGG TG-3'和MMP-12 Loaded-757序列5'-TGC CAC GTA TGT CAT CAG CA-3'。其反应条件为：94℃预变性2 min，然后94℃变性30 s，58℃退火 45 s，72℃延伸1 min，进行29个循环。（3）实时荧光定量PCR扩增目的基因：GAPDH的引物上、下游分别是5'-ACC ACA GTC CAT GCC ATC AC-3'和5'-TCC ACC ACC CTG TTG CTG TA-3'。反应条件：94℃预变性2 min，94℃变性30 s，61℃退火45 s，72℃延伸1 min，进行29个循环。扩增反应结束后，利用图像分析系统测定各条带杂交信号强度并与内参照GAPDH条带相比，计算出各mRNA的相对表达水平。

1.7 统计学方法

采用SPSS 13.0软件，所有计量资料以均数±标准差（±s）表示，多个样本均数比较用方差分析，两两比较采用SNK-q检验，相关性分析采用Pearson积差法进行相关分析。P＜0.05认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 组织学观察结果

伤后6 h，A组损伤节段灰质内有大片出血灶，神经细胞肿胀、破坏，大量炎性细胞浸润（图1A）；伤后24 h，大量神经细胞坏死，小胶质细胞吞噬现象明显（图1B）；伤后7 d，损伤中心坏死空腔形成，边缘有大量胶质细胞（图1C）；伤后14 d，炎性反应更加明显。B组损伤后各时间点上述病理改变均较A组明显减轻（图2）。C组脊髓组织各形态结构完整，各层细胞排列整齐，无水肿。

2.2 兔后肢运动功能评分

3 组改良Tarlov评分在伤后各时间点相比较，差异具有统计学意义（P＜0.05），A组伤后同时间点的运动功能评分均低于B组（P＜0.05），C组各时间点的评分维持在正常恒定水平（表1）。

2.3 MMP-2、12表达

A、B、C 3组各时间点均有MMP-2 mRNA表达，C组免疫组化染色未见MMP-2高表达（图3），且各时间点的表达较为恒定（表2）。伤后24 h A、B组MMP-2表达达到高峰（图4），伤后7 d A、B组MMP-2仍有高表达（图5）。伤后同时间点比较，A、B组MMP-2表达明显高于C组，差异具有统计学意义（P＜0.05）。A组MMP-2表达在伤后24 h、48 h、7 d 3个时间点高于B组，差异具有统计学意义（P＜0.05）；而两组在伤后6 h、14 d两个时间点比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。MMP-12的表达结果与MMP-2类似（表3）。

图1 全瘫组脊髓损伤后组织学观察

表1 三组改良Tarlov评分比较（n=42，±s）

表1 三组改良Tarlov评分比较（n=42，±s）

注：*与C组比较，P＜0.05；#与B组比较，P＜0.05

组别A组B组C组F值P值伤后1 h 6.06.06.00.0001.000伤后6 h 0.0*#2.1±0.2*5.2±0.175.8740.000伤后24 h 0.0*#1.9±0.2*5.6±0.181.2760.000伤后48 h 0.0*#2.6±0.1*5.9±0.089.2310.000伤后7 d 1.0±0.1*#3.1±0.1*6.09.6920.001伤后14 d 1.4±0.1*#3.4±0.2*6.08.5640.002

图2 不全瘫组脊髓损伤后组织学观察

表2 急性脊髓损伤后各时间点动物MMP-2阳性细胞表达率（%，n=25，±s）

表2 急性脊髓损伤后各时间点动物MMP-2阳性细胞表达率（%，n=25，±s）

注：*与C组比较，P＜0.05；#与B组比较，P＜0.05

组别A组B组C组F值P值伤后6 h 28.7±0.6*16.0±0.5*6.1±2.53.3100.121伤后24 h 61.0±1.2*#45.1±0.9*7.2±1.96.1450.014伤后48 h 57.5±0.7*#42.4±0.5*6.6±0.212.8850.000伤后7 d 51.5±0.6*#39.7±0.5*6.4±0.111.6080.00144.9±1.2*36.2±0.7*6.5±0.23.0630.123伤后14 d

表3 急性脊髓损伤后各时间点动物MMP-12实时荧光定量CT值（%，n=25，±s）

表3 急性脊髓损伤后各时间点动物MMP-12实时荧光定量CT值（%，n=25，±s）

注：*与C组比较，P＜0.05；#与B组比较，P＜0.05

组别A组B组C组F值P值伤后6 h 23.7±0.9*21.2±0.6*10.5±0.53.1540.125伤后24 h 35.4±1.2*#26.4±0.8*10.6±0.55.9780.018伤后48 h 33.9±0.7*#25.7±1.0*10.2±0.310.5890.000伤后7 d 27.9±0.6*#21.8±0.9*10.8±0.49.6120.001伤后14 d 21.0±1.2*20.0±0.5*10.4±0.43.2300.120

2.4 脊髓损伤程度与MMP-2阳性细胞表达率及MMP-12荧光定量CT值相关性分析

脊髓损伤程度与MMP-2阳性细胞表达率及MMP-12荧光定量CT值相关性分析采用Pearson积差相关分析（图6，7）。脊髓损伤后A、B组不同时间点MMP-2阳性细胞表达率与兔改良Tarlov评分的相关系数为r=-0.887，P=0.000；A、B组不同时间点MMP-12实时荧光定量CT值与兔改良Tarlov评分的相关系数为r=-0.841，P=0.002。说明MMP-2阳性细胞表达率和MMP-12实时荧光定量CT值与兔运动功能评分呈负相关。

图6 MMP-2阳性细胞表达率与兔改良Tarlov评分的关系

图7 MMP-12实时荧光定量CT值与兔改良Tarlov评分的关系

3 讨论

作为高致残疾病之一，急性脊髓损伤（acute spinal cord injury，ASCI）后的神经功能修复一直是医学界极具挑战性的难题。目前针对脊髓损伤的相关研究主要集中于ASCI后脊髓内继发性病理损伤的预防和治疗。研究认为，多种因素参与了脊髓的继发性损伤：局部缺血和再灌注损伤、血—脊髓屏障破坏、自由基生成、脂质过氧化、细胞凋亡以及炎症介质、一氧化氮、内皮素、血管内皮生长因子/渗透性因子、血小板活化因子、兴奋性氨基酸等的作用。继发性脊髓损伤正是上述神经生化机制和血管机制相互关联、不断恶化的过程。故其治疗主要针对ASCI后出血、水肿、微循环障碍、局部组织自由基生化改变等一系列继发性损伤。

MMPs是一组锌依赖的蛋白水解酶，具有降解多种细胞外基质（excellular matrix，ECM）成分（如胶原、层粘素、明胶、弹性硬蛋白、粘连蛋白及蛋白多糖等）的功能，因此对需要基质重建的生理过程如生长发育、创伤愈合及修复等起到重要作用[2]；此外，MMPs还与生理机能调节、信号发送、血管生成以及细胞运动等密切相关，在肿瘤转移、中枢神经系统损伤（如多发性硬化症、中风等）、AIDS及创伤等多种疾病的发展过程中有异常表达[3-5]。

Agrawal等[6]认为，MMPs对正常中枢神经系统的发育过程起到了调节作用，但当出现神经障碍时，MMPs成员则表现为异常的表达上调。近年来大量基础研究表明，MMPs参与了脊髓损伤后的多个病理过程[7-11]。ECM由细胞间的多种蛋白质和非蛋白质组成，构成细胞生活的微环境，具有支持、连接、营养和防御等生理作用，而血管基底膜与ECM是维持血—脊髓屏障完整的重要结构，MMPs可以通过降解ECM成分使血—脊髓屏障受损，通透性增加，毛细血管内的水分与血浆蛋白外渗，致细胞间隙内水分增多，进而形成脊髓水肿[10]。研究还证实，MMPs在脊髓损伤后的炎症反应、细胞凋亡等事件中扮演了重要角色[1,11]。MMP-2、12是MMPs的重要成员，在正常组织中无表达或低表达，在损伤后脊髓组织中呈高表达。Buss等[12]的相关研究显示，MMP-1、2、9、12均参与人类的继发性脊髓损伤过程，认为它们的高表达可导致蛋白质破裂、中性白细胞和巨噬细胞浸润而引发破坏性炎性事件，并通过增强血—脊髓屏障通透性来进一步加重脊髓损伤。de-Castro等[8]报道鼠脊髓损伤后MMP-2、9的高表达，MMP-9的活性在12～24 h达到高峰，致伤后5 d MMP-2仍维持在较高水平，因而推测MMP-2、9对脊髓损伤后ECM崩溃具有促进作用。Dang等[11]发现，MMP-2转录在实验动物脊髓损伤后显著上调，而抑制MMP-2/MMP-9活性可使脊髓损伤区域内细胞凋亡明显减少，提示伤后MMP-2的上调伴随着神经元和神经胶质细胞的凋亡，抑制细胞凋亡可通过降低MMP-2、9活性来实现，这一结果支持脊髓损伤后MMP-2导致细胞凋亡的推论，证实脊髓损伤治疗干预中应用MMP-2抑制剂抑制凋亡进而减轻脊髓损伤程度的可行性。本实验的前期研究发现，MMP-2、12在急性脊髓损伤后的表达不仅存在量的显著性不同，且定位、时空分布同样存在差异[13]；本实验对兔ASCI后MMP-2、12的表达及与损伤程度、损伤后时间点的相关性观察结果亦显示，脊髓损伤后6 h MMP-2、12表达增加，伤后24 h达高峰，并持续高水平表达至第7天，假手术组则维持在较恒定的低水平；且MMP-2、12的表达水平与脊髓损伤的程度呈负相关，揭示了MMP-2、12在ASCI后继发性损伤发展过程中的重要作用，同时也表明，ASCI后早期应用MMPs抑制剂下调MMP-2及MMP-12的表达水平可能会进一步减轻脊髓继发性损伤的程度。

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11 Dang AB,Tay BK,Kim HT,et al.Inhibition of MMP2/MMP9 after spinal cord trauma reduces apoptosis[J].Spine,2008,33(17):E576-E579.

12 Buss A,Pech K,Kakulas BA,et al.Matrix metalloproteinases and their inhibitors in human traumatic spinal cord injury[J].BMC Neurol,2007,7:17.

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