1-[18F]氟代乙基-L-色氨酸的半自动化合成

孙 婷,王世真,唐刚华,李兆陇

(1.中国医学科学院北京协和医学院,北京协和医院核医学科,北京 100730;2.中山大学附属第一医院 核医学科,广东广州 510080;3清华大学 化学系,北京 100084)

18F-氟脱氧葡萄糖(18F-FDG)是目前临床应用最广泛的一种PET显像剂,它可以反映体内葡萄糖代谢。但18F-FDG PET显像的特异性不高,不是所有肿瘤细胞对18F-FDG都有摄取,而且有时炎症也出现阳性,难以区分炎症和肿瘤[1,2]。

肿瘤细胞的生长除了需要大量摄取葡萄糖,还需要大量氨基酸,尤其是必需氨基酸。肿瘤浓集氨基酸的主要原因是肿瘤细胞氨基酸代谢高于正常组织,表现在氨基酸需要量增加和氨基酸转运增加两个方面[2]。根据这一特点,设计新型氨基酸类似物,寻找新的 PET显像剂,弥补FDG显像的不足,特别是对炎症和肿瘤的鉴别。最近 Lee等研究核素标记的酪氨酸18F-FET与18F-FDG在小鼠炎症和肿瘤模型对比显像,发现18F-FET在区分炎症肿瘤方面有可能克服FDG的不足[3],并在脑肿瘤显像方面日益显示出一定的潜力[4]。

几乎所有的氨基酸都可进行11C标记,如甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、丝氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、赖氨酸和环丁氨酸等[5]。但11C的半衰期只有20 min,使其应用受到限制;18F的半衰期为110 min,可用于较长时间、复杂的放化合成标记,是较理想的标记用同位素。18F标记方法分为亲核反应和亲电反应两种[6]。用分子态氟(18F·F)进行的亲电反应对设备要求高,副产物多,分离纯化复杂,因此,其推广应用深受限制。目前国内的18F标记研究多采用离子态氟(18F-)进行亲核氟化,但只有少数具有活泼基团的氨基酸才能够采用这种亲核氟化标记方法。

已用18F标记的氨基酸有酪氨酸[4,7-8]、蛋氨酸[9]、亮氨酸[10]、3,4-二羟苯基-L-丙氨酸(L-多巴)[11]等,其中临床应用最广泛的氟标记氨基酸是L-多巴[11]。最近李瑞芬等[12]合成了一种新型5-羟基色氨酸衍生物5-18FEHTP。上述标记的氨基酸大多数是含有酚羟基或巯基等活泼基团的氨基酸。而色氨酸既是必需氨基酸,又是体内唯一含有吲哚环的氨基酸,但它不含有酚羟基或巯基,标记困难,国内外均未见到直接在吲哚环上进行18F标记的报道。

本研究拟采用亲核氟化方法及18F-FET的合成思路,使用多功能合成模块,设计并合成新的PET显像剂1-[18F]氟代乙基-L-色氨酸(1-[18F]FETrp),期望用于炎症和肿瘤的鉴别。

1 实验设计及合成路线

根据色氨酸结构特点,除了功能团外,在吲哚环的N-H键用氟乙基取代,形成1-FETrp,具有化学反应的可行性,步骤简单,符合放射化学合成的要求[13]。但吲哚环上的氮不活泼,必须先将氨基和羧基保护,才能够与1-氟-2-对甲苯磺酰基乙烷(FCH2 CH2 OTs)反应,最后脱掉氨基和羧基保护。合成路线示于图1。

图1 1-[19 F]FETrp的合成路线

2 实验方法

2.1 仪器与试剂

JOEL JNM-ECA 300型核磁共振波谱仪:清华大学产品;Bruker Esquire-LC/MSn型质谱仪:Bruker Daltonics公司产品;高效液相层析紫外检测器:配1200Series二元泵,安捷伦科技有限公司产品;Finpak SIL C-18S HPLC分析柱(4.6 mm×150 mm),日本JASCO产品;放射性检测器:美国BIOSCAN产品;计算机控制化学合成模块(CPUC):北京PET公司产品;固相萃取柱(Sep-Pak):Waters公司产品。

无水 DMSO、无水乙腈、无水 K2 CO3、氨基聚醚K2.2.2购于Sigma-A ldrich;1,2-对甲苯磺酰基乙烷购于 Tokyo KASEI,其他试剂购于北京化学试剂公司。

2.2 1-[19 F]FETrp的合成

2.2.1 1-氟-2-对甲苯磺酰基乙烷(19FCH2 CH2OTs)的合成

将3.15 g(10 mmol)四正丁基氟化铵三水合物溶于30m L无水乙腈中,在N2保护下加热至90℃,蒸干溶剂。再加入30 m L无水乙腈,蒸干溶剂,重复3次,得到黄色油状物,然后在N2保护下加入30 m L溶有3.7 g(10 mmo l)TsOCH 2 CH 2OTs的无水乙腈,90℃下反应6 h,蒸干溶剂,产物用硅胶柱分离,洗脱剂为V(石油醚)∶V(乙酸乙酯)=10∶1。所得产品为淡黄色油状物,0.76 g,产率60%,熔点21～22 ℃[14]。

2.2.2 N-BOC-L-色氨酸(1)的合成

L-色氨酸4.08 g(20 mmol)置于200m L圆底烧瓶,加入100 m L水和1,4二氧六环的混合物(体积比为 1∶1)和 1 mol/L氢氧化钠(NaOH)20 m L,然后缓慢滴入 4.36 g(20 mm ol)二碳酸二叔丁酯。室温下搅拌24 h,用1 mol/L盐酸将反应液pH调至2.4,用乙酸乙酯萃取2次,每次40 m L,干燥、减压蒸干得到白色固体 4.56 g。产率 75%,熔点 136～138 ℃[15]。

2.2.3 N-BOC-L-色氨酸乙酯(2)的合成

将3.04 g(10 mm ol)N-BOC-L-色氨酸溶于30 m L无水二甲基亚砜(DM SO)中,加入0.48 g(12 mm ol)NaOH,加热到 40℃,搅拌20 m in。加入2.16 g(20mm ol)溴乙烷,再快速搅拌2 h,此后加入120 m L去离子水,析出淡黄色固体,过滤、干燥,得到固体3.1 g。分别采用硅胶柱和双相重结晶方法对产品进行分离。硅胶柱分离:所得粗品溶于少量二氯甲烷,过硅胶柱;洗脱剂为石油醚与乙酸乙酯,洗脱梯度依次为10∶1、8∶1和6∶1;得到2.39 g化合物2,白色固体,产率72%,熔点168℃。双相重结晶分离:将所得粗品加热溶于10 m L乙酸乙酯,加入6倍体积的石油醚,静置5 h,出现针状白色晶体,过滤、干燥得到化合物2。此法操作简单,适合大量制备,但产率只有60%,低于硅胶柱分离法。

2.2.4 N-BOC-1-氟乙基-L-色氨酸乙酯(3)的合成

0.996 g(3mmol)化合物2溶于6m L无水DMSO,加入NaOH 0.12 g(3mm ol),室温下搅拌 5 min,加入19FCH2 CH2 OTs 0.654 g(3mmol),继续搅拌20min,产物中加入30m L去离子水,用乙酸乙酯萃取3次,每次10m L,合并有机相,以无水MgSO4干燥。蒸干溶剂,得到0.685 g产物。将所得产物溶于少量二氯甲烷,用硅胶柱分离;按照石油醚与乙酸乙酯浓度比为20∶1、18∶1、15∶1、12∶1和 10∶1依次洗脱。最后得到0.325 g化合物3。产品为白色固体,产率30%,熔点99～101℃。

2.2.5 1-[19F]FETrp(4)的合成

0.225 g化合物3溶于3m L无水DMSO,加入1 m ol/L NaOH 0.72 m L(1.2 equiv),室温下搅拌15 m in。加入17 m L去离子水,乙酸乙酯萃取后,用1 mo l/L盐酸将水相调pH至2.4,用乙酸乙酯萃取3次,每次10 m L,合并有机相,干燥、减压蒸干溶剂,得到淡黄色固体。在该物质中加入10 m L饱和盐酸甲醇溶液,室温下搅拌30min,减压蒸干溶剂,得到的产物用乙酸乙酯洗3次,每次5 m L,干燥,得到化合物4的盐酸盐形式,为白色固体,久置后呈淡黄色。产率80%,留样备用,作为合成1-[18F]FETrp的标准品。

2.2.6 HPLC分析

将上述各种中间产物及1-[19F]FET rp进行HPLC分析,检测波长为254 nm。配制不同的流动相,根据产物保留时间的长短,选择适合的流动相和流速。

2.3 自动化合成

多功能合成模块主要包括18F-分离、氟化水解和HPLC分离等部分。它是由气体传输系统、真空泵、反应瓶、贮液瓶、接收瓶、废物瓶、阀门、分离小柱,HPLC、电加热、管路及计算机控制系统等组成。

2.3.1 C1-[19F]FETrp的半自动化合成

24 mg19FCH2CH2OTs和24 mg N-BOCL-色氨酸乙酯前体溶解在1m L无水DMSO/NaOH(pH=9)中,在反应瓶中通入氮气搅拌,加热至100℃,反应10min,反应液中加入1m L 8 mol/L盐酸,水解 10 min,此后加入 1 m L 8m ol/L NaOH 中和,用 HPLC分析,检测波长254 nm。

2.3.2 1-[18F]FET rp的半自动化合成

采用18O(p,n)F核反应生成F-,应用2m L H2O[18O]富氧水(95%)靶,在回旋加速器上用16.5 MeV、25μA的质子束流连续轰击20m in,得到反应所需要的18F-富氧水溶液。富集在QMA离子交换树脂柱上的18F-用1.5 m L K2.2.2溶液洗脱至反应瓶,通入氮气,在116℃下蒸干。加入2m L乙腈除去残留水,加入1m L溶有8 mg(NH2OTs)2的无水乙腈,95℃反应5min。冷却,加入10 m L无水乙醚,过硅胶小分离柱(Silica Sep-Pak,Waters公司),蒸除乙醚。加入溶有8 mg N-BOC-L-色氨酸乙酯的无水DMSO/NaOH(pH=9)1m L,120℃搅拌反应15 min。加入 1 m L 8 m ol/L HCl水解,100℃密闭反应10min,最后加入1m L 8 mol/L NaOH中和。

酵母菌与人类的生产生活关系密切。在史前时期，酵母菌就帮助人类的祖先酿酒，人类才开始有甘润醇香的美酒享用。约在6 000年前，酵母菌开始帮助人类发面，人类开始有松软的馒头、面包享用。

3 结果与讨论

3.1 标准品1-[19 F]FETrp的合成与鉴定

1-[19F]FET rp的合成虽然比较复杂,国内外均未见到有关报道,但是从化学反应机制考虑,反应可以进行。1-[19F]FETrp标准品的合成采用有机合成方法,以色氨酸为原料,经七步反应,每一步都分离纯化,得到目标产物。采用ESI-MS、1H NMR和13C NMR对各个中间产物和终产物进行结构鉴定。

(1)19FCH2CH2OTs的鉴定结果。ESIMS:m/z=241[M+Na]+;1H NMR(300 MHz,CDCl3):δ7.75(d,2H,J=7.9),7.31(d,2H,J=7.9),4.17(s,1H),4.53(d t,2H,JH-F=47.0 Hz,JH-H=4.80 Hz),4.21(dt,2H,JH-F=27.5 H z,JH-H=4.80 H z),2.40(s,3H)[13]。

(2)N-BOC-L-色氨酸鉴定结果。ESI-MS:m/z=327[M+Na]+;1H NMR(CDCl3):δ 8.13(br,1H,Ind-NH),7.61(d,1H,J=7.6H z,Ind-7-H),7.37(d,1H,J3=8.1Hz,Ind-4-H),7.15～7.11(m,2H,Ind-5,6-H),7.03(s,1H,Ind-2-H),5.06(br,1H,NHBoc),4.68～4.64(m,1H,C*H),3.37～3.31(m,2H,NH2)1.43(s,9H,CH3)。

(3)N-BOC-L-色氨酸乙酯鉴定结果。ESIMS:m/z=355[M+Na]+;1H NMR(300 MHz,CDCl3):δ8.12(s,1H),7.55(d,1H,J=8.01 H z),7.33(d,1H,J=7.89 H z),7.07～7.21(m,2H),6.99(s,1H),5.08(br,1H),4.62(br,1H),4.11(m,2H),3.28(br,2H),1.41(s,9H),1.16(t,3H);13C NMR(75 MHz,CDCl3):δ172.4、155.4、136.2、127.8 、122.8、122.2、119.6、118.9、111.2、110.4 、79.9 、61.4 、54.4 、28.4 、14.2 。

(4)N-BOC-1-氟乙基-L-色氨酸乙酯鉴定结果。ESI-MS:m/z=401[M+Na]+;1H NMR(300 MHz,CDCl3):δ7.59(d,1H,J=7.53 Hz),7.18～7.32(m,2H),7.13(t,1H,J=7.21 H z),6.96(s,1H,J=7.53 H z),4.64(dt,2H,JH-F=47.0 Hz,JH-H=4.80 H z),4.64(m,1H),4.30(dt,2H,JH-F=26.1 Hz,J H-H=4.80 H z),4.29(m,2H),3.29(br,2H),1.45(s,9H),1.20(t,3H,J=7.20 Hz);13C NMR(75 MH z,CDCl3):δ172.2、155.3、136.2、128.5 、126.8、121.9、119.4、119.1、109.7、109.1 、82.3(J=172.5 Hz),79.7 、61.3 、54.3 、46.4(J=22.5 H z),28.3 、27.9 、14.0 。

(5)1-[19F]FETrp鉴定结果。ESI-MS:m/z=273[M+Na]+;1H NMR(300 MHz,D2O):δ7.46(d,1H,J=8.01 Hz),7.18(d,1H,J=8.01 Hz),6.96～7.14(m,3H),4.51(dt,2H,JH-F=46.95 Hz,JH-H=4.80 H z),4.04～4.30(m,3H),3.19(m,2H);13C NMR(75 MHz,D2O):δ171.7 、136.4 、128.6 、127.2 、122.2 、119.7 、118.5 、110.0 、106.2 、83.5(J=165 Hz),53.2 、45.9(J=15 Hz),25.5。

1-[19F]FET rp合成过程中,最关键的一步反应是吲哚环氟乙基化,反应能否进行,取决于强碱能否顺利将吲哚环N上的氢夺下[16]。实验发现,在夺氢这步反应中,尽量保证无水条件和较快的搅拌速率,可以加快反应进程并提高产率。这步反应原料用的是保护的氨基酸,酯键在碱性条件下极易水解,因此碱的选用非常关键。强碱会使酯键水解,弱碱夺氢困难,反应速度慢,产率低,不适合放化反应的要求。工作中曾用氢氧化钠、叔丁醇钾、碳酸钾三种碱夺氢,但叔丁醇太强,碳酸钾太弱。溶剂的选用也比较重要,曾使用的多种溶剂中,只有用DMSO时发生反应。用NaOH和 DMSO,氟乙基化反应产率为30%,水解的产率为 80%,这 2步的总产率为24%。

3.2 1-[19 F]FETrp的 HPLC分析

图2 中间产物各标准品紫外吸收峰

3.3 1-[19 F]FETrp的半自动化合成

冷实验反应条件不适于微量的放射化学合成,因此将此反应路线半自动化,寻找适合放化合成的反应条件。根据本实验室现有设备,以及合成自动化加药的限制,只能将夺氢反应与亲核反应一步完成,先将强碱溶于溶剂,制备DMSO/NaOH溶液。寻找合适的碱强度,以及反应温度、时间。通过多次实验,结果发现,在反应液pH为7时,加热到100℃,反应10 min已经有产物生成,但是产率很低。随着pH的升高,产率逐渐增加,但是pH过高时,由于酯键的水解加速,形成了羧基,使得氟乙基与羧基盐反应,不与吲哚N反应,产物也将减少,甚至得不到产物。因此,将反应液pH调为8,在100℃下反应10m in,此条件下可以得到少量的产物。水解反应已经比较成熟,只要反应液中盐酸浓度达到4 m ol/L,100℃10min即可大部分水解。

3.4 1-[18F]FETrp的半自动化合成

3.4.1 半自动化合成条件的确定

本工作使用亲核氟化方法标记了新型色氨酸类似物1-[18F]FET rp。1-[18F]FET rp的放化合成需要三步反应,因此采用二锅法实现自动化操作。第一步是合成18FCH 2 CH 2OTs,第二步是N-BOC-L-色氨酸乙酯的氟乙基化反应,第三步是水解脱BOC和脱酯。合成最关键的一步是氟烷基化反应,这步反应的标记率决定了总的放化产率。

与冷实验相比,氟烷基化热实验反应条件苛刻,要求高,产率低;需要更强的碱性、更高的温度和更长的反应时间。实验结果表明,18FNH2NH2OTs的放化产率约为30%～35%,整个合成过程大约需要 20 min;第二步反应中,18FCH2CH2OTs在碱性条件下,极易水解成18F-,使放化产率很低。在冷实验的基础上分别测试了反应温度、时间、pH等因素对合成的影响,结果表明,只有当两种前体的质量比为1∶1、pH达到9时,100℃下反应 20 m in,才能生成少量的N-BOC-1-[18F]氟乙基-L-色氨酸乙酯,将反应温度升高到120℃,反应时间可缩短至15min。

3.4.2 各步产物的HPLC分析

对第一步反应产物进行HPLC分析,流动相为V(乙腈)∶V(水)=50∶50,流速2 m L/min,结果示于图 3。由图 3 可见,18FCH2CH2OTs保留时间为2.8 min;反应前体N-BOC-L-色氨酸乙酯保留时间为5.0m in。在9.3 m in处出现新放射峰,与标准品N-BOC-1-氟乙基-L-色氨酸乙酯保留时间一致(图2D),由此可推断新放射峰为N-BOC-1-氟乙基-L-色氨酸乙酯的放射峰。反应投入148 MBq的18F-,得到 51.8 MBq18FCH2CH2OTs,放化产率35%;氟乙基化得到 N-BOC-1-[18F]氟乙基-L-色氨酸乙酯 3.8 MBq,这步反应产率仅为8.6%。于是增加投入252 MBq的18F-,经过水解得到3.7 MBq 1-[18F]FETrp,对该步反应的产物进行 HPLC分析,流动相 0.1 mol/L NaH2PO4-5%EtOH,流速 2 m L/min,分析结果示于图4。图4中新出现的放射性吸收峰保留时间为9.1min,与标准品1-[19F]FETrp在pH值为12时的保留时间(图2C)一致。由图4放射吸收峰的积分面积计算可得,该步反应的产率为1.5%。经过至少 20 min的 HPLC分离纯化,根据半衰期计算产率,终产物放化产率不到1%,因此,未继续加大放射性投入量进行进一步分离纯化实验。

1-[18F]FET rp的放化产率很低,与冷实验条件下所得结果不符合,与反应本身的特点有关。反应前体N-BOC-L-色氨酸乙酯在碱性条件下极易发生酯键水解,使氟乙基与羧基反应,不与吲哚的N反应。反应中吲哚N基团不活泼,存在酯键竞争反应,只有酯键水解的速度明显低于吲哚夺氢的速度,才能够得到目标产物。要提高产率,尽量提高18FCH2CH2OTs的投入量,至少要使两种原料的比例适合,在冷实验中,投入的氟乙基量和色氨酸前体的量大致相等,因此,反应产率较高,反应容易进行。放化合成反应属于微量反应,计算的产率是放化产率而不是产物的剂量。18FCH2CH2OTs的质量是可估算的,远远小于色氨酸前体的质量,致使产率较低。从反应结果推测,在第二步亲核取代反应过程中,产生大量的18F-,使产率较低。另外,放化合成时,第一步亲核反应结束,18FCH2CH2OTs中可能存在少量分离不完全的TsOCH2CH2OTs参与第二步亲核反应,使反应复杂,副产物增多,产率降低。

图3 第一步反应产物的HPLC分析

图4 第二步合成产物的HPLC分析

4 结 论

本实验采用半自动化法合成了新型氟标记色氨酸类似物1-[18F]FETrp,总合成时间为50 min,分离纯化前,总放化产率1.5%;由于放化产率低,合成时间长,目前尚不适合推广应用,今后需要尝试其他碱性试剂或者寻找新的合成路线。

致谢:感谢中科院化学研究所博士生郝鹏、申淼,清华大学化学系博士生严晓宇、廖骞、研究生刘蕴东、陆文超在实验中给予的热心帮助;感谢中山大学附属第一医院核医学科易畅在实验中给予的帮助;感谢滕宝在论文书写方面给予的指导和帮助。

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