不稳定膀胱逼尿肌中 Cajal样间质细胞的分布△

新疆石河子大学医学院第一附属医院泌尿外科(石河子 832008)

李应龙 丁国富 王勤章* 李令勋 倪 钊 王新敏

逼尿肌不稳定(Detrusor instability,DI)又称不稳定膀胱(Unstable bladder,USB),是在膀胱充盈时,自发的或被诱发的不能被主动抑制的逼尿肌不自主收缩。是临床最常见的膀胱尿道功能障碍之一,与尿频、尿急、紧迫性尿失禁等多种症状的产生有关,但其发病机制尚不明确。 Cajal间质细胞(Interstitial cells of Cajal,ICCs)是存在于消化系统中,具有重要的起搏功能的一种特殊的间质细胞,它作为胃肠电活动的起搏者,在胃肠蠕动中起着重要的作用。 1996年,Smet和Jonavicius首先发现了在豚鼠和人逼尿肌上,存在着与ICCs在形态学及免疫学上类似的间质细胞[1]。由于该类细胞是否在膀胱中发挥其在胃肠管一样的功能尚有待进一步证实,故膀胱 ICCs被称为膀胱 Cajal样间质细胞或膀胱 ICCs样细胞,以与胃肠管 ICCs相区别。近年来,有关膀胱 ICCs样细胞的形态和功能研究表明,膀胱 ICCs样细胞可能具有起搏功能,与 DI的发生关系密切[2～5]。我们采用荧光免疫组织化学[6],观察膀胱逼尿肌中 ICCs样细胞的分布,探讨其与 DI的关系。现报告如下。

材料与方法

1 实验对象 健康雌性豚鼠 50只,购自昆明医学院动物中心,体重 250～ 300g,随机分为实验组(40只)和对照组(10只),实验组行尿道结扎建立膀胱出口梗阻模型,对照组仅行尿道分离术而不作结扎,饲养6周后行充盈性膀胱测压[7],确定 DI组 14只。测压后饲养 3d,处死豚鼠,取出膀胱,小心剔除黏膜层,标本经 4%甲醛固定 20～ 40 min,4℃条件下 0.01mol/L磷酸盐缓冲溶液(PBS)漂洗过夜,OCT包埋,恒冷箱冰冻机切片,厚 50 μm,-20℃保存备用。

2 免疫组织化学 组织切片室温下风干 30min,25℃ 1%牛血清蛋白液孵育 30min,加入酪氨酸蛋白激酶受体 (KIT)单克 隆抗 体 (ACK2,1∶ 100,eBIOSCIENCE公司)4℃ 48h,异硫氰酸荧光素(FITC)标记的兔抗大鼠 IgG抗体(1∶40,DAKO公司)25℃ 60min,水溶性封片剂封片,荧光显微镜观察,各步骤间用 0.01mol/L PBS漂洗 3次,每次 5min,加入一抗后所有步骤避光操作。对照实验以正常鼠血清代替一抗,或兔血清代替二抗,结果均为阴性。选取豚鼠肠壁为阳性对照,染色方法同上。每张切片取 4～5个视野,将数字化图像储存于计算机,实验结束后进行图像分析。

3 半定量分析及统计学处理 图片用 Image-Pro Plus 6.0软件进行量化,以 KIT阳性细胞占逼尿肌组织面积百分比为变量,所有数据以均数±标准差(x-±s)表示,采用 SPSS11.0统计软件进行 t检验,以 P＜0.05为有显著性差异,P＜0.01为有极显著性差异。

结 果

以下结果均以豚鼠空肠壁环形平滑肌层中 KIT阳性细胞为阳性对照(见图 1)。

1 ICCs样细胞的形态与分布 KIT阳性的ICCs样细胞在对照组和 DI组豚鼠膀胱逼尿肌组织中分布一致,它们的走向与逼尿肌肌束平行,主要都分布于逼尿肌肌束边缘和逼尿肌肌束中(见图 2～ 3)。两组细胞形态基本一致,呈梭形双极细胞,表现为以胞体为中心的向相反方向延伸的两个长突起 (见图 2～ 3)。在逼尿肌组织中可见阳性着色的肥大细胞,呈圆形,无突起,与 ICCs样细胞的形态截然不同(见图 4)。

2 ICCs样细胞的数量 DI组 KIT阳性细胞数量较对照组明显增多(见图 2～ 3)。通过半定量分析显示,DI组 KIT阳性细胞占逼尿肌组织面积的百分比(DI组 8.488%±3.440%)明显大于对照组(3.324%±2.114%),经统计学分析,P＜0.01,两组有极显著性差异。

图1 豚鼠空肠壁环形平滑肌层中 KIT阳性细胞为阳性对照(箭头所示);KIT免疫荧光染色×200

图2 对照组豚鼠逼尿肌中 KIT阳性细胞(箭头所示)呈梭形双极细胞,表现为以胞体为中心的向相反方向延伸的两个长突起。KIT阳性细胞走向与逼尿肌肌束平行,主要分布于逼尿肌肌束边缘(细箭头)和逼尿肌肌束中(粗箭头);KIT免疫荧光染色×200

图3 DI组豚鼠逼尿肌中 KIT阳性细胞形态与分布与对照组相似 (箭头所示),数量较对照组明显增多;KIT免疫荧光染色×200

图4 逼尿肌组织中肥大细胞(箭头所示),呈圆形,无突起,与 ICCs样细胞的形态截然不同;KIT免疫荧光染色 ×200

讨 论

逼尿肌具有和胃肠平滑肌相似的、不受神经控制的自发性肌源性兴奋性,其兴奋起源和调节机制目前尚不清楚。 ICCs在胃肠管兴奋起源、动力产生和功能调控方面的重要作用以及逼尿肌和胃肠管平滑肌相似的生理特性,让我们联想到该类细胞在膀胱中存在和发挥相似功能的可能性。近年来,随着对膀胱 ICCs样细胞形态和功能研究的深入,ICCs样细胞对膀胱动力的关键性调控作用引起了研究者们极大的关注。Mc-Closkey等[2]对新鲜分离的 ICCs样细胞采用激光共聚焦显微镜观察荧光标记的 Ca2+浓度变化情况,发现这些细胞具有自发性 Ca2+浓度波动,推测其在膀胱中可能具有起搏细胞样活性。

我们曾在此之前尝试过许多方法,如行膀胱组织石蜡切片及冰冻切片的免疫组织化学染色,均未得到很好的实验结果。本实验发现,对豚鼠膀胱组织采用组织冰冻切片,行 KIT免疫组织荧光染色的方法能较好地显示出 KIT阳性的膀胱 ICCs样细胞,是研究膀胱ICCs样细胞的可靠方法。本研究发现,对豚鼠膀胱组织采用组织冰冻切片,行 KIT免疫组织荧光染色的方法能较好地显示出 KIT阳性的膀胱 ICCs样细胞,是研究膀胱 ICCs样细胞的可靠方法。本研究结果显示的KIT阳性细胞主要分布于豚鼠逼尿肌肌束边缘和逼尿肌肌束中,而国外报道主要分布于豚鼠逼尿肌肌束边缘和逼尿肌肌束间结缔组织中[8],这种差别除豚鼠种族的原因外,可能与标本的处理,抗体的选择以及方法有关,需要更大规模的调查证实。在膀胱中,对 KIT阳性的细胞除 ICCs样细胞外,还有肥大细胞,但肥大细胞胞体呈圆形,无突起,与 ICCs样细胞极易区别。

与对照组相比,DI组逼尿肌中 ICCs样细胞数量明显增加,形态和分布上未见明显变化。这与国外报道的膀胱过度活动症患者逼尿肌中,ICCs样细胞数量明显增加的结果相似[9]。膀胱 ICCs样细胞与神经干和神经节连接紧密[8],而 KIT受体抑制剂甲磺酸伊马替尼可明显抑制正常豚鼠和 DI患者离体膀胱逼尿肌肌条的自发兴奋性,并可提高豚鼠膀胱的膀胱容量和膀胱顺应性[9,10],提示 ICCs样细胞与膀胱逼尿肌兴奋的起源和调控有密切的关系,可能就是膀胱的起博细胞。

综上所述,DI逼尿肌中 ICCs样细胞数量明显增加,可能增加了逼尿肌自身兴奋收缩性能,扰乱了神经系统与逼尿肌间的信息传递,进而导致了逼尿肌自发收缩活动增加,膀胱收缩功能发生紊乱。本研究结果表明膀胱中 ICCs样细胞数量的增多,可能是引起 DI产生的原因之一,ICCs样细胞可能就是理论上存在于膀胱的起博细胞。本研究结果为研究 DI发生机制及临床治疗膀胱功能障碍提供了新的依据。

[1]Smet PJ,Jonavicius J,Marshall VR,et al.Distribution of nitric oxide synthase- immunoreactive erves and identification of the cellular targets of nitric oxide in guinea-pig and human urinary bladder by cGM P immunohistochemistry[J].Neuroscience,1996,71(2):337-348.

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