血站HBsAg酶联免疫检测的HOOK效应及对策

吴人光

（娄底市中心血站，湖南 娄底417000）

对献血者感染乙肝病毒的检测大多数国家采用敏感性为 0.1～1.0μg/L酶联免疫吸附试验(ELISA)，具有高度的特异性、敏感性，又加上单克隆抗体技术及自动化设备的发展，试剂稳定，且操作简便、快速、无放射性污染，是采供血机构筛查献血者传染性指标的主要检测手段[1]。目前检测HB-sAg为ELISA双抗体夹心法[2]，按试验操作步骤分为一步法和二步法。由于一步法少了1次洗板及孵育过程，节省了时间，得到广泛应用。但在实际工作中，一步法易出现高剂量钩状效应（HD-HOOK effect），从而导致假低值，甚至假阴性。同时低值标本检测为阴性。笔者将工作中发现的出现HOOK效应的高值标本和低值标本，选用双抗原夹心一步法及二步法分别检测高值标本及倍比稀释后的标本及低值标本，探讨减少HOOK效应的对策，现报告如下。

1 对象与方法

1.1 研究对象

无偿献血者，女，29岁，B型，头次献血，男，35岁，A型，首次献血，前者为HBsAg高值标本，后者为低值标本。

1.2 试剂

初检试剂由上海科华生物工程股份有限公司提供，双抗体夹心二步法，批号20090810；复检试剂由珠海丽珠生物有限公司提供，双抗体夹心一步法，0090724。以上试剂均在有效期内使用。

1.3 仪器 RMP150全自动酶免分析系统 （瑞士帝肯公司）；。

1.4 方法 将HBsAg高值标本用PBS作倍比稀释，并分别使用上述两种试剂检测高值标本及倍比稀释后及未稀释的原液低值标本，所有步骤均严格遵守操作规程。

2 结果

2.1 两种方法检测献血者的结果

由表1可以看出，随着稀释倍数增加，一步法阳性越来越强，至1:32出现最高值，然后逐渐下降，HOOK效应十分明显。

2.2 两种方法检测献血者OD值结果

两方法检测男性献血者血样各20次，一步法：OD平均值0.095，SD为0.32，CV为25%，二步法：OD平均值0.107，SD为0.24，CV为18%。

3 讨论

ELISA双抗体夹心一步法反应体系中，待检标本及酶标抗ABsAg抗体同时加入微孔中，会形成4种产物：固相抗体-待测抗原-酶标抗体，固相抗体-待测抗原，待测抗原-酶标抗体，酶标抗体-待测抗原-酶标抗体。其中只有固相抗体-待测抗原-酶标抗原是目的结合物，最后会催化底物，产生反应信号；待测抗原-酶标抗体和酶标抗体-待测抗原-酶标抗体会在洗涤过程中被去除。当标本中待测抗原浓度过高时，由于竞争抑制作用，待测抗原-酶标抗体、酶标抗体-待测抗原-酶标抗体结合物相应增多，而固相抗体-待测抗原-酶标抗体相应减少，于是反应显色减弱，甚至完全不显色。其剂量反应曲线为钟行曲线，当待测抗原浓度在一定范围时，反应曲线随浓度的升高而上升，当浓度超过其线性范围时，其反应曲线并不呈平台状无限延伸，而呈向下弯落状，似一把钩子(HOOK)，即HOOK效应，从而导致强阳性标本检测结果为弱阳性甚至为阴性，低值(临界值附近标本)由于钩状效应中前带效应容易检测为阴性[3]。

表1 两种检测方法结果比较

双抗体夹心二步法是先将标本加到微孔中孵育一定时间，形成固相抗体-待测抗原结合物，洗板；再加入酶标抗HBsAg抗休，形成固相体-待测抗原-酶标抗体结合物，酶催化底物显色。从试验原理可以看出，当标本中HBsAg浓度过高和过低时，不会产生HOOK效应，从而避免一步法因HOOK效应而漏检高值和低值标本的现象发生。但是有研究报道，二步法测定具有多重抗原决定簇的大分子蛋白质抗原(如铁蛋白、AFP、HCG等)，分子本身具有变构作用，测定时也可发生HOOK效应但迄今为止未见双抗体夹心二步法发生HOOK效应的文献报道[4]。

本结果显示，随着稀释倍数增加，一步法阳性越来越强，至1:32出现最高值，然后逐渐下降，HOOK效应十分明显，低值标本(未稀释血浆标本)一步法检测为阴性，而二步法无此现象。

由于HOOK效应的发生具有不可预见性，减少和克服HOOK效应是较为棘手的问题。采用同步稀释法、PEG法、振动态ELISA法都可取得一定的效。但同步稀释法操作繁琐，成本高；PEG法、振动态ELISA法虽可使HOOK效应发生的临界浓度减少1～2个稀释度，但同时增加了非特异性反应。

综上所述，二步法是减少钩状效应较好且实用的方法，大部分血站用全自动酶免系统，可以减少因手工操作洗板带来的误差。血站检测标准是每个项目需要用不同的项目做初复检，在选择HBsAg检测试剂盒时，至少应选一种二步法试剂做初检或复检，以避免HOOK效应造成的强阳性标本与临界值附近标本(低值标本)漏检。

[1]申子瑜.我国血站实验室血清学标志物检测能力初探[J].临床输血与检验杂志,2007,9(2):170~172.

[2]曹文飞.酶联免疫测定的干扰因素与对策[J].中国实验免疫学杂志,1998,10(3):60.

[3]陈兆鹏,单永梅,周红芬,等.减少一步法ELISA钩状效应的方法探讨[J].上海医学检验杂志，1999,(14):59.

[4]郭东杰,刘秀敏,许连秀,等.振动态ELISA可抑制钩状效应[J].中国输血杂志,2002,15(3):171.