陈 颖,周建党,唐少华,伍 勇
(中南大学湘雅三医院检验科,湖南 长沙 410013)
阴沟肠杆菌是肠杆菌科中常见的细菌,存在于人体中的正常菌群,但随着各种广谱抗生素的广泛应用,以及各种侵入性诊断手段的增加,该菌已逐渐成为院内感染的重要病原体,其耐药性也发展成为临床抗感染治疗的重大难题。近几年来,AmpC酶对阴沟肠杆菌耐药性的影响倍受关注,金属酶对细菌的耐药性影响也成为研究热点。本文研究了近两年内湘雅三医院分离得到的120株阴沟肠杆菌AmpC酶和金属酶的表达情况,统计并分析了对其耐药性的影响关系,现将结果报告如下。
1.1 材料
1.1.1 实验菌株 2005年1月~2006年12月中南大学湘雅三医院临床标本中分离的阴沟肠杆菌120株。AmpC酶阳性质控菌株和阴性质控菌株分别为阴沟肠杆菌029M和029,金属酶的阳性质控菌株为铜绿假单胞菌ATCC27853,纸片扩散法的质控菌株为大肠埃希菌ATCC25922。
1.1.2 试剂和药敏纸片 试剂:纯EDTA-Na2购自上海化学试剂公司。药敏纸片:头孢噻肟(CTX),头孢曲松(CRO),头孢他啶(CAZ),头孢吡肟(FEP),头孢西丁(FOX),哌拉西林/他唑巴坦(TZP),环丙沙星(CIP),左氧氟沙星(LEV),阿米卡星(AK),氨曲南(ATM),亚胺培南 (IPM),阿莫西林/克拉维酸(AMC),复方新诺明(SXT)均为英国Oxoid公司产品。
1.1.3 培养基 胰蛋白胨与水解酪蛋白(MH)琼脂均购自英国Oxoid公司。
1.2 方法
1.2.1 细菌的分离、培养、鉴定 按《全国检验操作规程》进行细菌的分离和培养。所有实验细菌均采用Vitek2-compact(法国Bio-Merieux公司)全自动微生物鉴定仪鉴定系统进行鉴定。
1.2.2 AmpC酶初筛实验 采用纸片扩散 (K-B)法用头孢西丁纸片检测受试菌株抑菌圈,直径≤18mm者为疑产AmpC酶菌株[1]。
1.2.3 AmpC酶确证实验 ①酶初提物制备:挑取MH琼脂平板过夜培养的疑产AmpC酶菌株数个菌落加入10mL胰蛋白胨培养基中,35℃恒温摇床200r/min 过夜,4000r/min,4℃离心 20min, 弃上清液,沉淀中加入0.01mol/LPBS(ph7.0)1.5mL,充分混匀后,-60℃和 36.5℃各 30min反复冻融 5次,12000r/min 40℃离心20 min,吸取上清液即为酶初提物,置-20℃冻存备用。②头孢西丁三维确认实验[2]:将0.5麦氏单位大肠埃希菌ATCC25922菌液涂抹于MH琼脂平板,取一头孢西丁纸片置于平皿中心,用消毒刀片一端在离纸片边缘5mm处放射性的切出三道长约20mm宽约5mm的狭缝,一道狭缝加入酶初提物40μL,加入液体时避免溢出狭缝。35℃温箱过夜,若狭缝与抑菌圈交界处出现扩大生长区域视为三维实验阳性,即AmpC酶阳性。以阴沟肠杆菌029M为AmpC酶阳性对照,以阴沟肠杆菌029作为AmpC酶阴性对照。
1.2.4 金属β-内酰胺酶的检测 采用EDTA-亚胺培南纸片增效法[3]。秤取18.6克EDTA-Na2-2H2O溶于100mL蒸馏水中,用5mmol/L的NaOH调pH至8.0,制备成0.5mmol/LEDTA溶液,高压蒸汽灭菌备用。在MH平板上均匀涂抹待测菌,分别贴2张亚胺培南纸片,纸片距离为30-40mm,其中一张纸片加EDTA溶液5μL,35℃孵育24h,若加EDTA的亚胺培南纸片抑菌环直径比不加EDTA的纸片≥7mm为金属酶阳性。
1.2.5 药敏实验 纸片扩散(K-B)法按美国国家实验室标化研究所(CLSI/NCCLS)标准操作规程进行,检测试验菌株对每种抗生素的耐药性。药敏结果依据 CLSI/NCCLS(2006)[4]判断。
1.3 统计方法 结果采用WHONET5,SPSS13.0软件进行统计分析,耐药率比较采用χ2检验。
2.1 Am pC酶初筛和确证实验检测结果
AmpC酶纸片法初筛实验和三维确认实验的检出率分别是48.3%(58/120)和32.5%(39/120),相关性为67.2%。
2.2 金属酶纸片增效法的检测结果
亚胺培南-EDTA增效法检测120株阴沟肠杆菌中阳性菌株6株,检出率为5%(6/120)。
2.3 Am pC酶阳性与Am pC酶阴性的阴沟肠杆菌对13种抗生素药敏结果
分离得到的120株阴沟肠杆菌中,AmpC酶阳性菌株对头孢曲松、头孢噻肟和头孢西丁耐药率高于AmpC酶阴性菌株,其差异具有统计学意义(P<0.05)。AmpC酶阳性菌株对氨曲南耐药率低于AmpC酶阴性菌株,差异具有统计学意义(P<0.05)。结果见表1
2.4 金属酶阳性与金属酶阴性的阴沟肠杆菌对13种抗生素药敏结果
120株阴沟肠杆菌中金属酶阳性菌株对除阿米卡星和阿莫西林/克拉维酸外11种抗生素的耐药率明显高于金属酶阴性菌株,差异具有统计学意义(P<0.05),结果见表 2。
阴沟肠杆菌是一种重要的条件致病菌,目前已成为院内感染的主要致病菌。近年来,由于头孢菌素、碳青霉烯类抗菌药物在临床上广泛使用,使阴沟肠杆菌在其选择压力下不断发展多种耐药机制,对多种抗生素具有较高的耐药性,已引起临床的高度重视。
表1 Am pC酶阳性与Am pC酶阴性阴沟肠杆菌对13种抗生素耐药率比较(%)
表2 金属酶阳性与金属酶阴性阴沟肠杆菌对13种抗生素耐药率比较(%)
AmpC酶为染色体或质粒介导的ClassC类酶,属于Bush分类中的Ⅰ类酶[5],其活性中心是丝氨酸,能够水解第三代头孢类抗生素的β-内酰胺环,不能被β-内酰胺酶抑制剂 (克拉维酸和EDTA)抑制[6],编码基因为AmpC基因。部分阴沟肠杆菌只产生少量的AmpC酶,但当三代头孢菌素选择下AmpC酶的产量明显增加,导致临床上产AmpC酶情况逐年加重。本实验120株阴沟肠杆菌,通过头孢西丁纸片扩散法初筛有58株AmpC酶阳性,经过三维确证实验确定AmpC酶菌株为39株,检出率为32.5%(39/120),与国内外文献报道比较一致[7],两实验比较相关性为67.2%。三维实验是AmpC酶的确证实验,阴沟肠杆菌对头孢西丁必须进一步三维确证实验。
本组资料显示,AmpC酶阳性的阴沟肠杆菌对13种抗生素的耐药率除氨曲南外,其余12种抗生素的耐药性普遍高于AmpC酶阴性菌株,但仅有三代头孢菌素中头孢曲松,头孢噻肟,及头霉素中头孢西丁的耐药率明显高于AmpC酶阴性菌株,差异具有统计学意义(P<0.05)。AmpC酶阴性菌株对氨曲南的耐药率明显高于AmpC酶阳性菌株,具有统计学意义(P<0.05),可能是由于AmpC酶阴性菌株中存在超广谱β-内酰胺酶。阴沟肠杆菌对头孢吡肟和亚胺培南较敏感,AmpC酶阳性菌株的耐药率为15.4%,AmpC酶阴性菌株的耐药率为7.4%。此结果证实了四代头孢菌素对AmpC酶的结合力较低,稳定性好且能快速的通过细菌的外膜屏障与其结合,可以作为临床治疗产AmpC酶菌株的首选药物。亚胺培南是强AmpC酶诱导剂,但因其具有比较特殊的空间构象,较高的抗菌活性,能够在诱导产生足量AmpC酶之前杀死细菌,所以 临床上仍选择该药。
金属酶属于Bush分类中的第3群,其活性中心不是丝氨酸,而是金属离子,该酶对β-内酰胺酶抑制剂敏感差,不被克拉维酸,舒巴坦抑制,但能水解包括碳青霉烯类如亚胺培南、美罗培南在内的一大类β-内酰胺类抗生素,其主要特征是在二价金属离子,主要是锌离子的存在下才有活性。可被EDTA等金属鏊和抑制剂抑制。金属酶以多聚体形式存在,半胱氨酸、丝氨酸和天冬氨酸等活性部位的氨基酸与锌结合,锌再结合水分子使其活化成为亲和试剂,从而进攻并水解碳青酶烯等β-内酰胺类抗生素。近年,碳青霉烯类抗生素耐药的临床分离株有缓慢增长的趋势,尽管与其它β-内酰胺酶相比耐药株数量较少,但比其它耐药性β-内酰胺酶引起的更为严重广泛。报道检测金属酶表型的方法主要有纸片协同法、纸片增效法、和E试验等方法[8],这些方法的原理都是利用其活性可被EDTA抑制。但目前,国际上无检测获得性金属酶的公认推荐方法。本文采用的是亚胺培南-EDTA增效法,该方法操作简便,不需要特殊的仪器设备。120株阴沟肠杆菌中有6株金属酶为阳性,检出率5%(6/120),高于其它文献的报道[9],可能与碳青霉烯类抗生素的过度使用有关。现今,金属酶在阴沟肠杆菌中表达不多见,但产金属酶的菌株对多种抗生素耐药现象明显,已逐渐成为临床上控制耐药菌株的难题。金属酶阳性菌株对除阿米卡星外其它12种抗生素均表现出中度或重度耐药,除其中的阿莫西林/克拉维酸外11种药物的差异均具有统计学意义(P<0.05),多重耐药现象严重,说明金属酶的底物广泛,对细菌的耐药性影响很大,但具体机制尚未研究清楚。本实验中有关金属酶对阴沟肠杆菌作用的药敏结果可能与其他地区的结果不一致,这与不同地区使用抗生素情况不同或菌株在产金属酶同时可能存在其他的耐药机制有关。目前,对这种产金属酶的阴沟肠杆菌引起的感染的治疗方法没有理想的方案。可以停用碳青霉烯类抗生素,再根据体外药敏结果选择合适的抗菌药物联合治疗。
临床上产生耐药的原因有很多。其中不合理使用第三代头孢菌素和碳青霉烯类抗生素是产生AmpC酶和金属酶的主要原因。反复长期使用广谱抗生素,不适当的联合、长期用药或药物更新过快,引起机体内菌群的平衡失调,正常菌株被抑制或杀死,耐药株大量繁殖,激素和免疫抑制剂过度使用,导致患者免疫力下降,使得耐药株流行。同时,患者本身的身体素质和基础疾病也对耐药株的产生有一定的影响。此外,临床部分侵袭性的操作,无菌操作不严格等情况加之住院时间和大量药物的使用,及交叉感染的可能都会影响耐药株的产生和流行,在临床上防治产酶菌感染可以从以下几个方面着手:严格抗生素的使用范围,一般不提倡预防性使用抗生素,追踪检查病原菌耐药性改变和流行趋势。同时应建立预警机制,各种抗生素分批次地交换使用,加强无菌观念和院内感染地监督,防止医源性的交叉感染,严格激素和免疫抑制剂的使用,促使患者基础疾病尽快康复,减少住院日。
总之,合理使用第三代头孢菌素和碳青霉烯类抗生素是减少AmpC酶和金属酶的关键,同时实验室也应该积极开展对这两种酶的检测,深刻了解认识耐药机制,严格遵守体外抗菌药物敏感试验的结果,合理选择抗菌药物,以控制细菌耐药株产生和流行。
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