API通过耗竭GSH抑制人肝癌Hep G2细胞活性和诱导凋亡

李 超 ，全梅芳 ，黄秋林 *

（1.南华大学附属第一医院，湖南 衡阳420001；2.湖南师范大学医学院，湖南 长沙 410013）

芹菜素 (apigenin,API)是一种黄酮类化合物,广泛分布于蔬菜和水果中,尤以芹菜中含量为高；在一些药用植物如车前子、络石藤等中也有很高的含量，植物源性饮料如茶、红酒以及一些调味品中也有存在。API的化学结构为5,7,4'-三羟基黄酮，其分子式为C15H10O6，相对分子质量为270。Chiang等[1]研究发现在Hep G2,Hep3B和PLC/PRF/5这3种肝癌细胞系中，API可显著抑制细胞的生长，但在鼠源正常肝细胞系BNLCL.2细胞中，无此效应。在Hep G2肝癌细胞中，API的效力和抗肝癌药5-氟尿嘧啶 (5-Fu)的效力相似。Kachadourian R检测到一些黄酮类化合物包括API诱导A549细胞、HL-60细胞和PC-3细胞谷胱甘肽(glutathione,GSH)耗竭[2]。本文研究API是否通过耗竭细胞GSH发挥抑制人肝癌Hep G2细胞活性和诱导细胞凋亡作用。

1 材料与方法

1.1 药品与试剂 API和GSH由美国Sigma公司出品；CellTiter 96 AQueoous细胞增殖检测试剂盒由普洛麦格公司(中国北京)生产；碘化丙啶（PI）由美国英杰生物技术公司出品；GSH和GSSG检测试剂盒由南京凯基生物技术有限公司(中国南京)出品。

1.2 细胞与细胞培养 人肝癌Hep G2细胞系细胞来自中国典型培养物保藏中心(中国武汉)。用含10%小牛血清的RPMI-1640培养基，加100 U/mL青霉素，100 U/mL链霉素，置于37℃，5%CO2及饱和湿度培养箱中培养，取对数生长期细胞用于实验。

1.3 细胞内GSH含量测定 按照GSH和GSSG检测试剂盒说明书的步骤操作，用722可见光分光光度计，以412nm波长测定吸光度(A)值。从工作标准曲线获得GSH的浓度值。

1.4 MTS比色法测定 按照CellTiter 96 AQueoous细胞增殖检测试剂盒操作说明书的步骤完成，用EXL-800酶联免疫检测仪，以490nm波长测定吸光度(A)值。

1.5 PI染色FCM分析 参照文献[3]描述的方法操作。用EPICS XL流式细胞仪(美国COULTER公司)测定10000个细胞的DNA含量，SYSTEM II软件分析Sub-G1细胞百分率。

1.6 统计学分析 实验数据以mean±SD表示，应用SPSS15.0统计软件进行单因素方差分析（One-way ANOVA）。如果方差具有齐性，用LSD法进行多样本均数之间的两两比较；如果方差不齐，采用Tuker HSD进行多样本均数之间的两两比较。P＜0.05认为差异具有统计学显著性意义。

2 结果

2.1 API对Hep G2细胞GSH水平的影响

分光光度法测定结果表明，API以浓度依赖方式降低Hep G2细胞GSH水平(P＜0.05)。补充外源性GSH(500 μM GSH预孵育30min)能有效消除API耗竭细胞GSH作用。

比色法测定细胞内GSH浓度。数据为3次实验的mean±SD，与溶媒组比较，*P＜0.05；与溶媒组比较，**P＜0.01；与5.0 API处理组比较,#P＜0.05；与单用相同浓度API处理组比较,$P＜0.05。

2.2 GSH耗竭对API抑制Hep G2细胞活性的影响

图2示，API显著抑制Hep G2细胞活性，呈浓度依赖性(P＜0.05)。 补充外源性 GSH(500 μM GSH预孵育30min)能阻断API抑制细胞活性作用。

MTS法测定细胞活性。数据为3次实验的mean±SD，与溶媒组比较，*P＜0.05；与溶媒组比较，**P＜0.01；与溶媒组比较，***P＜0.001；与 5.0 API处理组比较,#P＜0.05； 与单用相同浓度API处理组比较,$P＜0.05。

2.3 GSH耗竭对API诱导Hep G2细胞凋亡的影响

图3表明，API有效地诱导Hep G2细胞Sub G1百分率增高，呈浓度依赖性(P＜0.05)。补充外源性GSH(500 μM GSH 预孵育 30min)能有效阻断 API诱导细胞凋亡作用。

PI染色FCM分析细胞Sub G1细胞百分率。数据为3次实验的mean±SD，与溶媒组比较，**P＜0.01；与溶媒组比较，***P＜0.001； 与 5.0 API处理组比较,#P＜0.05；与 5.0 API处理组比较，##P＜0.01；与单用相同浓度API处理组比较,$P＜0.05；$$,与单用相同浓度 API处理组比较，P＜0.01。

3 讨论

细胞内GSH耗竭作为一种肿瘤细胞化疗增敏策略的研究已有十多年了[4]。有研究发现三磷酸腺苷结合盒转运体的表达并不一定导致抗癌药物的耐受，反而，根据细胞的类型与药物种类，可能增强药物作用[5]。多药耐药蛋白介导的谷胱甘肽外排很有可能作为一种选择性的治疗靶点利用，因为，在肿瘤细胞往往表现出更高水平的活性氧与高表达MRPs[6]因此，本文首要的目的是观察无基因毒性的黄酮API是否能够耗竭人肝癌Hep G2细胞GSH。我们采用分光光度法测定细胞GSH水平，结果证明，API以浓度依赖方式降低Hep G2细胞GSH水平(图1)。 补充外源性GSH(500 μM GSH 预孵育30min)能有效消除API耗竭细胞GSH作用。这些结果与Kachadourian R等[2]在A549细胞、HL-60细胞和PC-3细胞研究的结果一致。

既然API具有耗竭Hep G2细胞GSH的作用，那么细胞GSH耗竭是否影响API抑制Hep G2细胞活性和诱导细胞凋亡作用呢？在接下来的实验研究中，本文采用MTS比色法检测细胞活性，并用PI染色FCM定量分析细胞凋亡率,观察外源性GSH的干预效果。我们实验研究的结果表明，API显著抑制Hep G2细胞活性，呈浓度依赖性(图2)。补充外源性GSH(500 μM GSH预孵育30min)能阻断API抑制细胞活性作用。另外，API有效地诱导Hep G2细胞凋亡率增高 (图3)。补充外源性GSH(500 μM GSH 预孵育30min)能有效阻断API诱导细胞凋亡作用。这些结果说明API耗竭Hep G2细胞GSH是其抑制细胞活性和诱导细胞凋亡的主要原因之一。

通常，细胞GSH耗竭可导致活性氧生成，激活线粒体凋亡诱导途径。最近张雪梅等[7]的研究提示：以线粒体为靶点的药物有助于克服与P-gp表达有关的多药耐药。因此，API通过耗竭细胞GSH抑制人肝癌细胞活性和诱导细胞凋亡的特性值得深入评价其作为人肝癌预防和治疗剂以及化疗增敏剂的价值。

[1]Chiang LC,Ngl T,Lin IC,et al.Anti-proliferative effect of apigenin and its apoptotic induction in human Hep G2 cells[J].Cancer Lett,2006,237(2):207-214.

[2]Kachadourian R,Day BJ.Falconoid-induced glutathione depletion:potential implications for cancer treatment[J].Free Radic Biol Med.2006，41(1):65-76.

[3]王莉,向红琳,曹建国,等.染料木黄铜衍生物抗血管内皮氧化应激损伤的活性筛选[J].湖南师范大学学报(医学版),2009,6(3):12-15.

[4]BenllochM.,OrtegaA,FerrerP,etal.Accelerationofglutathione effluxand inhibitionofgamma-glutamyltranspeptidasesensitize metastatic B16 melanoma cells to endothelium-induced cytotoxicity[J].JBiolChem,2005,280:6950-6959.

[5]Szakacs G,Annereau JP,Lababidi S,et al.Predicting drug sensitivity and resistance:profiling ABC transporter genes in cancer cells[J].Cancer Cell,2004，6:129-137.

[6]Kruh GD,Gaughan KT,Godwin A,et al.Expression pattern of MRP in human tissues and adult solid tumor cell lines[J].J Natl Cancer Inst,1995,87:1256-1258.

[7]张雪梅,杨秀蓉,吴华,等.线粒体凋亡途径在H2O2诱导耐阿霉素人乳腺癌细胞凋亡中的作用[J].第三军医大学学报,2009,31(15):1475-1478.