芹菜素敏化TRAIL诱导人卵巢癌CoC1细胞凋亡

唐爱琼 ，刘杰 ，刘 飞 ，曹建国 ，谢宛玉 ⋆

（1.南华大学第一附属医院，湖南 衡阳，421001；2.湖南师范大学医学院，湖南 长沙，410013）

肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand,TRAIL)是由Wiley等[1]于1995年克隆成功的TNF超家族的又一成员,通过与受体的特异性结合而诱导肿瘤细胞和恶性转化细胞凋亡,对正常组织细胞无毒性作用,由于其对肿瘤细胞的选择性杀伤作用而有望成为新型的抗肿瘤制剂。但是，有研究表明，60%的肿瘤细胞对TRAIL诱导的凋亡不敏感[2],而TRAIL与放射线、化疗药物联合应用对大多数肿瘤细胞表现出协同杀伤效应,并且能提高肿瘤细胞对TRAIL的敏感性[3]。

芹菜素(apigenin,API)的化学结构为5,7,4'-三羟基黄酮，其分子式为C15H10O6，相对分子质量为270；现已可人工合成，是一种来源充足、作用广泛、具有广阔开发前景的天然植物成分。有研究发现API(20～160μmol/L)能抑制人卵巢癌细胞系CAOV3细胞的生长，且呈明显的时间、剂量依存性关系，可能通过使CAOV3细胞停滞在G2/M期而诱导其凋亡从而抑制细胞的增殖[4]。本文集中研究亚细胞毒浓度的芹菜素对重组人可溶性肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体 (TRAIL)诱导人卵巢癌CoC1细胞凋亡的增敏作用。

1 材料与方法

1.1 试剂 芹菜素(apigenin,API)由美国Sigma公司出品；重组人可溶性肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)由英国PeproTech公司生产；碘化丙啶（PI）由美国英杰生物技术公司出品；Caspase 3 Activity Detection Kit由美国Millipore公司出品。

1.2 细胞培养 人卵巢癌CoC1细胞购于中国典型培养物保藏中心（中国武汉市），用含10%小牛血清的RPMI-1640培养基，加100 U/mL青霉素，100 U/mL链霉素，置于37℃，5%CO2及饱和湿度培养箱中培养，取对数生长期细胞用于实验。

1.3 流式细胞术分析 取对数生长期的卵巢癌CoC1细胞，用含0.1%的小牛血清的培养基处理24h进行细胞周期同步化后，分别加入含标示终浓度受试物的完全培养基作用48h；0.1%DMSO作为溶媒对照。细胞收集于1.5mL EP管中，用4℃的75%乙醇固定24h后，经碘化丙啶（PI）染色，用流式细胞仪测定细胞DNA含量。以上实验重复2次。

1.4 Caspase-3活性测定 未处理与经受试物处理48h的细胞3×106~5×106个，按Caspase-3比色法检测试剂盒说明书进行操作。用酶标仪在λ=405nm测定其吸光值。通过计算A(诱导剂)/A(阴性对照)的倍数来确定凋亡诱导剂的caspase-3活性程度。以裂解缓冲液和反应缓冲液的混合物作为参比。以上实验重复2次。

1.5 统计学分析 实验数据录入Spss 15.0 for windows evaluation软件，建立数据库，各组实验数据均用mean±SD表示，用One Way ANOVA行方差分析。P＜0.05为统计学意义显著标准。

2 结果

PI染色FCM 分析结果发现：API(20μmol/L)和TRAIL(20ng/mL)两者合用的sub-G1细胞百分率是API(20μmol/L)与 TRAIL(20ng/mL)单独使用的 sub-G1细胞百分率之和的405%(P＜0.001,图1)。表明亚细胞毒性浓度的API能够有效促进TRAIL导致人卵巢癌CoC1细胞凋亡。

PI染色FCM分析HeLa细胞Sub-G1细胞百分率。数据为3次独立实验的均数±标准差，n=3。与溶媒组比较，⋆P＜0.05， 与溶媒组比较，⋆⋆⋆P＜0.001;与单用相同浓度的API或TRAIL处理组比较，###P＜0.001。

2.2 芹菜素、TRAIL及两者合用对人卵巢癌CoC1细胞Caspase-3活性的影响

ELISA法测定发现：溶媒组与API(20μmol/L)和TRAIL(20ng/mL)以及两者合用处理人卵巢癌CoC1细胞48h，细胞Caspase-3的活性分别是培养基对照组的1.1、1.3、1.4和6.5倍。可见亚细胞毒性浓度的芹菜素与亚细胞毒性浓度的TRAIL合用显著增加CoC1细胞Caspase-3活性（图2）。

3 讨论

卵巢癌生长隐秘、迅速，早期即可在腹腔内种植扩散，卵巢癌在确诊时70%～80%均为晚期[5]，而且，卵巢癌化疗易产生耐药性和严重药物毒副作用，卵巢癌的5年生存率迄今没有得到明显改善[6]。寻求高效、低毒的卵巢癌药物治疗方法具有重大的社会、经济效益和广阔的临床应用前景。

ELISA法检测Caspase-3的活性，数据为3次独立实验的均数±标准差，n=3。 与溶媒组比较，⋆⋆⋆P＜0.001；与单用相同浓度的API或TRAIL处理组比较，###P＜0.001

近年来关于TRAIL与化疗药物联合用于肿瘤治疗的实验研究逐渐被报道。Wu等[7]体外研究发现TRAIL与化疗药物合用能明显增强TRAIL诱导的肿瘤细胞的凋亡,即使一些对TRAIL不敏感的细胞,在TRAIL与化疗药物联合应用后仍表现出较强的促凋亡效应。Tomek等[8]分别对6种卵巢癌细胞系MZ-26,CaOV-3,ES-2,A2780,A2780ADR,MZ-15研究发现,TRAIL对MZ-26,CaOV-3,ES-2细胞比较敏感,单独应用诱导其凋亡率达到80%以上,而A2780,A2780ADR,MZ-15细胞对TRAIL并不敏感,但与常规化疗药物联合应用后,3种细胞都表现出很强的凋亡效应。

芹菜素是一种大量存在于水果和蔬菜中常见饮食黄酮类化合物，被认为具有防治癌症的潜在价值[9]。本文用PI染色FCM分析结果与文献[10]结果相类似，发现亚细胞毒性浓度的API能够有效促进TRAIL导致人卵巢癌CoC1细胞DNA降解 (sub-G1细胞百分率增高，图1)。本文在接下来的实验研究中，采用ELISA法测定Caspase-3的活性。我们的实验结果表明，亚细胞毒性浓度的芹菜素与亚细胞毒性浓度的TRAIL合用显著增加CoC1细胞Caspase-3活性，证明：亚细胞毒性浓度的芹菜素具有显著增强TRAIL诱导人卵巢癌CoC1细胞凋亡作用。

恶性肿瘤通常表现出细胞增殖和生长失控及细胞凋亡的减少,在肿瘤治疗中抑制癌细胞的增殖和生长,只能减缓恶性肿瘤的进展,但不能治愈肿瘤。而诱导细胞凋亡的意义则更大。许多研究显示肿瘤的耐药产生与凋亡受抑有关。TRAIL具有广谱、高效、特异的诱导肿瘤细胞凋亡效应，对于卵巢癌的治疗提供了一个新的治疗策略，特别是本文实验研究证实无基因毒性的饮食黄酮芹菜素具有增敏TRAIL诱导人卵巢癌CoC1细胞凋亡作用；因此，联合芹菜素和TRAIL有望成为极具推广应用潜力的新卵巢癌治疗方式。

[1]Wiley S R,Schooley K,Smolak P J,et al.Identification and characterization of a new member of the TNF family that induces apop tosis[J].Immunity,1995,3:673-682.

[2]Ganten TM,Haas TL,Sykora J,et al.Enhanced caspase-8 recruitment to and activation at t he DISC is critical for sensitisation of human hepatocellular carcinoma cells to TRAIL-induced apoptosis by chemotherapeutic drugs[J].Cell Death Differ,2004,11(Suppl 1):S86-S96.

[3]Cuello M,Ettenberg SA,Nau MM,et al.Synergistic induction of apoptosis by the combination of trail and chemotherapy in chemoresistant ovarian cancer cells[J].Gynecol Oncol,2001,81(3):380-390.

[4]杜俊瑶,辛彦.芹菜素抑制人卵巢癌CAOV3细胞增殖的研究[J].中国实用妇科与产科杂志,2007,23(5):374-375.

[5]Gronlund B.Progressive epithelial ovarian carcinoma Prognostic factors and clinical management[J].Dan Med Bull,2006,53(3):232-257.

[6]Chan YM,Ng TY,Ngan HY,Wong LC.Quality of life in women treatd with neoadjuvant chemotherapy for advanced ovarian cancer:a prospective longitudinal study[J].Gynecol Oncol,2003,88(1):9-16.

[7]Wu XX,Ogawa O,Kakehi Y,et al.TRAIL and chemotherapeutic drugs in cancer therapy[J].Vitam Horm,2004,67(4):365-370.

[8]Tomek S,Horak P,Pribill I,et al.Resistance to TRAIL induced apoptosis in ovarian cancer cell lines is overcome by co-treatment with cytotoxic drugs[J].Gynecol Oncol,2004,94(1):107-112.

[9]Golkar L,Salabat MR,Ujiki MB,et al.Apigenin inhibits pancreatic cancer cell proliferation via down-regulation of hypoxia inducible factor-1α (HIF-1α)and the glucose transporter(GLUT-1)[J].J Surg Res,2007,137(2):191-192.

[10]Horinaka M,Yoshida T,Shiraishi T,Nakata S,Wakada M,Sakai T.The dietary flavonoid apigenin sensitizes malignant tumor cells to tumor necrosis factor-related apoptosisinducing ligand[J].Mol Cancer Ther， 2006，5(4):945-951.