结核分枝杆菌耐氧氟沙星临床分离株gyrA基因突变的研究

闫丽萍, 肖和平, 郑瑞娟, 胡忠义, 乐 军, 景玲杰

为了解结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)耐氧氟沙星临床分离株gyrA基因突变与氟喹诺酮类药物接触史的关系,我们随机筛选20株耐氧氟沙星的MTB临床分离株行gyrA基因喹诺酮耐药决定区(quinolone resistance-determining regions,QRDR)序列测定,并调查这20株菌株的氟喹诺酮类药物接触史,现将结果报道如下。

材料与方法

一、材料

(一)MTB临床分离株 2007年8月—2008年5月自上海市肺科医院收治的肺结核患者痰标本分离、筛选出的耐氧氟沙星菌株,共20株,其中3株严重耐多药(extensive-drug resistant,XDR),14株耐多药(multi-drug resistant,MDR),1株多耐药(poly-drug resistant,PDR),2株单耐氧氟沙星;H37Rv为试验对照用标准MTB菌株。

(二)抗菌药物 链霉素、异烟肼、利福平、乙胺丁醇(均为美国BD公司产品)、卷曲霉素(浙江海正药业股份有限公司)、阿米卡星(上海旭东海普药业有限公司)和氧氟沙星(日本第一制药株式会社)。

(三)培养基 PNB鉴别培养基、TCH鉴别培养基、改良7H9液体培养基。

二 、方法

(一)痰标本MTB的分离、培养与鉴定 参照《结核病诊断细菌学检验规程》[1]。

(二)MTB的药物试验 应用BACTEC-960法检测搜集的MTB临床分离株对链霉素、异烟肼、利福平、乙胺丁醇、卷曲霉素、阿米卡星和氧氟沙星的敏感性,根据BACTEC-960的操作手册,上述药物所采用的浓 度 分别 为 ：1.0、0.1、1.0、5.0、1.0、2.5、2.0 mg/L,耐药百分率大于1%则认为受试菌对该药物耐药。

(三)H37Rv和耐氧氟沙星的MTB临床分离株DNA提取与gyrA目的片段285 bp的扩增、测序采用经典的酚∶氯仿∶异戊醇法提取M TB全染色体DNA作为模版,基因扩增在美国ABI2720 themo cycler PCR仪上进行,引物序列为 P1 5'-CAG CTA CAT CGA CTA TGC GA-3'、P2 5'-GGG CTT CGG TGT ACC TCA T-3'。热循环为94℃预变性4 min,然后按94℃1 min,60℃1 min,72℃1 min,循环40个周期,进行PCR产物电泳(见图1)。扩增产物经乙醇纯化后与引物P1和四色荧光标记试剂(美国PE公司提供)混匀,按94℃1 min,55℃2 min,72℃4 min,循环 30个周期。在美国ABI3130XL型 genetic analyzer测序仪上测序(见图2)。

结 果

H37Rv gyrA的QRDR测得序列与美国国立生物信息中心核酸数据库已登录的H37Rv株序列完全一致[2]。与H37Rv株序列的差异比较显示20株临床株的gyrA第95位密码子均为ACC(H37Rv为AGC),为天然的多态现象[3]。18株存在有义突变,突变率为90%。其中2株第91位密码子由TCG(丝氨酸)→CCG(脯氨酸),3株第90位密码子由CCG(脯氨酸)→GTG(缬氨酸),10株第94位密码子由GAC(天冬氨酸)→GGC(甘氨酸),2株第94位密码子由GAC(天冬氨酸)→GCC(丙氨酸),1株第94位密码子由GAC(天冬氨酸)→GTC(缬氨酸),其中以第94位密码子的GAC(天冬氨酸)→GGC(甘氨酸)最为多见。

20株菌株的耐药类型及既往氟喹诺酮类药物应用情况：既往未应用过氟喹诺酮类药物6例,均为MDR(其中2例初治,2例初治复发,2例初治失败)。2例曾在结核确诊前应用氟喹诺酮类药物经验性抗感染治疗1周患者,为单耐氧氟沙星(均为初治病例)。12例曾联合应用氟喹诺酮类药物抗结核治疗(1例为初治复发,11例为多次治疗失败或复发)患者,其中4例为XDR,7例为MDR,1例为PDR,见表1。20株MTB临床分离株的耐药谱见表2。

表1 不同FQs接触史的菌株gyrA的QRDR突变情况Table 1.QRDR mutations in gyrA of strains with different fluoroquinolones exposure history

表2 20株M TB临床分离株的耐药谱Table 2.Antibiotic resistant pattern of 20 clinical isolates of M.tuberculosis

讨 论

氟喹诺酮类药物主要通过抑制DNA旋转酶A(gyrase A)亚单位与DNA的结合,从而抑制结核菌DNA的复制与表达,达到对M TB的杀灭作用[4]。gyrA是DNA旋转酶A亚单位的编码基因,它的突变导致氟喹诺酮类药物无法与DNA旋转酶A亚单位结合,使MTB对氟喹诺酮类药物产生耐药[5]。本次实验的20株耐氧氟沙星MTB临床株中共18株发现了有义突变,分别在第90例、91和94位密码子上。未发现有文献报道的第88位[6]及74位[7]密码子的突变,也未发现在同一株MTB上存在gyrA双突变的情况[8]。本实验中有2株氧氟沙星耐药株(10%)未发现gyrA突变,提示gyrA突变不是MTB耐氟喹诺酮类药物唯一的机制。Kocagoz等[8]曾对未发现 gyrA突变的菌株行gyrB检测,发现了gyrB上第495位密码子的突变。另外还有研究者提出泵蛋白对药物的泵出作用[9]及细胞外膜对药物的通透性降低[10]、细菌适应药物环境的调节机制(如毒素-抗毒素系统)[11]均可导致MTB对氟喹诺酮类药物耐药。最近,研究人员又在MTB中发现了一种能够模拟DNA的蛋白质MfpA[12],其表达使M TB对环丙沙星和司帕沙星产生耐药,这可能是解释氟喹诺酮耐药的新机制。而本次实验中的2株无gyrA突变的氧氟沙星耐药株对氧氟沙星的耐药机制尚不明确,有待进一步的研究。但通过本实验可以明确的是gyrA突变是MTB对氟喹诺酮类药物耐药的主要机制,且以其第90、91和94位密码子的有义突变为主。

关于氟喹诺酮类药物诱发gyrA突变的时间折点问题目前的报道则更少。在本次研究中有2例初治患者仅于肺结核确诊前接受1星期的氟喹诺酮类药物经验性抗感染治疗,确诊后的首次药敏试验即出现了单独对氧氟沙星的耐药及MTB gyrA的突变。由此看来极有可能单一应用氟喹诺酮类药物1周即可产生诱发gyrA的突变。但由于本次实验未收集到这2例患者应用氟喹诺酮类药物前的菌株,故此结论暂时还不能成立,但仍建议临床医师在结核病不能完全排除时经验性抗感染治疗应避免使用氟喹诺酮类药物。

本次研究还发现6例未应用过氟喹诺酮类药物的患者对氧氟沙星耐药,且这6株均为MDR菌株。临床病例调查发现这6例患者均为初治或首次复治患者,故考虑这些患者很可能是感染了耐氧氟沙星的MDR菌株。其中5株也仍存在gyrA突变,提示gyrA突变具有一定的稳定性,在停止接触氟喹诺酮类药物后并持续传代的过程中不易恢复敏感性。

通过本次实验,我们得到以下启示：gyrA基因突变是MTB对氟喹诺酮类药物产生耐药的机制之一;gyrA基因的有义突变主要发生在第90、91和94位密码子上。

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