细菌的耐药性与适应性

李 颖, 杨 帆

一些临床重要病原菌耐药性的迅速增长对抗感染治疗构成了严重威胁,寻找细菌耐药性增长的原因及相应防治措施成为当务之急。目前认为细菌耐药性的传播主要取决于病原菌(细菌本身的适应性)、抗菌药物(抗生素选择压力)和宿主(免疫力)3个因素的相互作用[1-2]。众多研究表明细菌耐药性的增长与抗生素的选择压力有关,但过去很长一段时间的研究更多关注抗菌药物的抗菌活性和细菌耐药机制。近年来对于细菌耐药性与其适应性关系的研究为分析细菌耐药性增长的原因和探讨如何降低耐药性提供了新的视角,成为感染性疾病领域的一个研究热点。

适应性(fitness)一般是指细菌为了生存与繁殖而调节自身代谢以适应环境条件(如温度、pH、渗透压、抗生素等)的能力[3]。病原体的适应性包含以下要素：在感染宿主和环境中不同菌株的繁殖(竞争)的相对效率;在宿主间的传播能力;被感染宿主清除的情况[4]。本文主要就细菌的耐药性与适应性的关系作一综述。

一、耐药菌株的适应性代价

有临床和实验室证据证实,肺炎链球菌在对青霉素的敏感性和其菌株毒力之间存在相关性。Ho等[5]测定了181株肺炎链球菌菌株的药敏结果,血流感染分离株中青霉素耐药肺炎链球菌(PRSP)占33.3%,明显低于其他部位分离株PRSP比率(73.8%,P＜0.01)。而在免疫功能健全的小鼠体内,接种野生型(wild)耐药肺炎链球菌并不能诱发实验性肺炎[6]。Azoulay-Dupuis等[7]研究了122株肺炎链球菌临床株,其中32株毒力株均对青霉素敏感,而41株对青霉素耐药或敏感性下降的菌株均无毒力,结果显示侵袭性肺炎链球菌大部分是青霉素敏感的,非侵袭性菌株大多数是青霉素不敏感的。

在观察到耐药细菌的生长繁殖能力和致病力可能较敏感细菌低的现象后,国外很多学者进行了许多有关细菌耐药性与适应性关系的研究(表1)。例如T rzcinski等[18]把肺炎链球菌青霉素敏感株,和插入青霉素结合蛋白基因的同源青霉素耐药株同时接种于幼鼠鼻腔,并在其后4～5 d通过鼻腔冲洗液观察两者数量比值的变化,结果青霉素耐药株在幼鼠上呼吸道定植力与敏感株相比随着青霉素结合蛋白耐药基因的表达数目增加而降低。比较腹腔内接种青霉素敏感株和插入pbp2b、pbpx基因的同源青霉素耐药株的小鼠的半数致死量(LD50),结果显示耐药株的LD50[分别为(6.0±0.6)和(6.7±0.3)log10CFU/小鼠]比敏感株[(2.0±0.6)log10CFU/小鼠]高,耐药株毒力较敏感株显著下降[19]。Gillespie等[30]推测PRSP株适应性降低的主要原因可能是耐药性菌株改变了细胞壁组成,由此导致的细胞壁合成所需的酶的底物、活性和亲和力的变化增加了青霉素耐药株的代谢负担。适应性降低的现象同样见于喹诺酮类和大环内酯类抗菌药耐药肺炎链球菌菌株[20-23]。

对其他细菌的研究也都显示细菌获得耐药性突变后可引起其在体外或动物体内适应性降低的结果。如体外诱导的rpoB基因突变耐利福平结核分枝杆菌H37Rv(ATCC9360),与其同源敏感株共同孵育后计算两者繁殖世代的比值,观察到突变耐药株的世代数较同源敏感株少,也就是说前者的体外竞争繁殖能力较后者低[15]。另外有2项关于鼠伤寒沙门菌的研究显示,由于rpsL、rpoB和gyrA基因突变而分别对链霉素、利福平和萘啶酸耐药的鼠伤寒沙门菌的大部分(6株/7株)对小鼠无毒力[8],而由于rpsL基因的核苷酸置换AAA42→AAC而对链霉素产生耐药性的鼠伤寒沙门菌,核糖体蛋白S12的氨基酸置换(K42N)引起核糖体校对率(rate of ribosomal proofreading)的上升,从而使得蛋白合成和细菌生长速度减慢,细菌毒力降低[9]。Kanai等[24]在研究中发现,分离自同一患者分别对大环内酯类抗生素耐药(23SrRNA基因突变)和敏感的幽门螺杆菌株,在单独培养时未表现出生长速率的显著性差异,当混合培养时,随着连续传代,耐药株与敏感株菌落数量的比值逐渐减小,提示耐药株在适应性上有所降低。一项通过测定耐喹诺酮类药物铜绿假单胞菌的体外生长速率的研究结果显示,前者的生长速率较其同源敏感株低[25]。Sánchez等[26]的研究表明,2株体外选择的多重耐药铜绿假单胞菌突变株(nalB和nfxB)在水中的生存力,产蛋白酶和菌株毒力均较敏感株有所下降,推测可能是由于外排泵耐药机制不仅泵出了抗生素,也泵出了大量代谢产物,增加了菌株的代谢负担。

表1 染色体靶位突变引起的耐药性相关适应性代价Table 1.The biological cost of resistance conferred by target-altering chromosomal mutations

除了染色体靶位的突变,肠杆菌科细菌和其他革兰阴性菌的耐药性常由质粒介导。也有许多研究报道了与携带耐药质粒相关的适应性代价,Lee等[31]的研究证实携带含有TcR(四环素耐药)基因质粒pBR322的大肠埃希菌体外生长速率降低。Lenski等[32]分析与染色体靶位突变引起的细菌适应性下降机制不同的是,携带耐药性相关质粒而导致适应性降低的原因可能是质粒在缺乏抗生素选择压力下不稳定状态所造成的,这也就使得不携带耐药质粒的敏感菌株生长繁殖更多。

这些研究提示细菌产生耐药性常常改变了细菌的核糖体、DNA旋转酶、RNA聚合酶、细胞壁等重要结构,导致细菌生长速度、定植能力和毒力等的下降,即细菌耐药性的获得需要付出适应性代价(fitness cost)[33]。因此,耐药菌株的竞争优势可能仅表现在存在抗生素选择压力时,当无抗菌药选择压力时其适应性反而可能较敏感株低。

二、适应性代价的补偿

多数研究已经证实耐药会引起适应性代价,但也有研究观察到一些无显著适应性代价的耐药突变(表1)。如Björkman等[10]的研究发现,rpsL基因突变导致对链霉素耐药的鼠伤寒沙门菌中部分菌株毒力并无明显降低,在这些菌株同时发现了rpsD或rpsE基因突变。一项通过测定体外生长速率评价竞争莫匹罗星耐药和糖肽类中介的金葡菌(GISA-2)、莫匹罗星敏感和糖肽类中介的金葡菌(GISA-1)和Mu50菌株生长情况的研究结果表明异亮氨酰-tRNA合成酶点突变的GISA-2菌株的体外生长繁殖能力无明显降低[27]。Ramadhan等[29]在研究中比较了对万古霉素耐药和敏感的肠球菌的体外最大生长速率,未显示前者适应性降低。

诸多实验表明,这是由于耐药菌株进一步发生补偿突变,使得其适应性恢复(表2)。如Björkman等[8]发现由于rpsL、rpoB和gyrA基因突变所致链霉素、利福平和萘啶酸耐药的鼠伤寒沙门菌的多数(6株/7株)对小鼠无毒力,但这些耐药菌株很快通过不同形式的补偿突变在维持耐药性的同时恢复菌株毒力。经过序列分析rpsL基因突变耐药株存在rpsL基因内补偿突变(42位点和93位点的ACA序列、AAC序列和CGT序列发生突变),一些突变株的毒力甚至超过了敏感株,提示可能存在rpsL基因外补偿突变机制。而gyrA和rpoB基因突变耐药株则通过基因内补偿突变恢复了菌株毒力。而由于katG基因突变而对异烟肼产生耐药性的结核分枝杆菌也通过基因外补偿突变(高表达ahpC基因),在维持耐药性的同时也恢复了毒力[34]。

同样的对于携带耐药质粒而使得细菌适应性降低的情况,也有报道补偿突变的发生。McDermott等[35]的研究证实携带含有 TcR(四环素耐药)基因的质粒pBR322的大肠埃希菌一开始最大生长速率降低,经连续传代后获得了适应性补偿,由于耐药质粒的结构和数目并无明显变化,提示可能细菌染色体发生了补偿突变。Bouma等[36]的研究也显示虽然一开始携带pACYC184非结合质粒的大肠埃希菌的体外适应性是降低的,但当在抗菌药选择压力下传代500代时,细菌染色体出现了适应补偿(而非质粒本身改变),从而使得细菌的适应性升高。其他研究结果也提示抗生素选择压力存在的情况下,大多数细菌通过染色体适应性突变从而克服携带质粒的适应性缺陷[30]。

细菌适应性代价及其补偿在不同条件下有其不同的意义。如已知肺炎链球菌野生株可以通过PgdA和Adr 2种酶修饰肽聚糖的不同部位,PgdA对N-乙酰葡萄糖胺脱乙酰基,Adr乙酰化N-乙酰胞壁酸酯,从而造成对溶菌酶的耐受。Davis等[37]在研究中在溶菌酶 M(LysM+/+)和溶菌酶缺陷(LysM-/-)的小鼠模型中,同时接种肺炎链球菌野生株和pgdAadr突变株,结果发现在LysM+/+小鼠中野生株占绝对优势,在LysM-/-小鼠中突变株占优势,提示肽聚糖的修饰本身在降低了菌株在无溶菌酶存在条件下的竞争能力,但对溶菌酶的耐受性补偿了其在寄殖中适应性代价(通常存在溶菌酶)。

目前大多数观点认为适应性代价意味着耐药株在无抗生素环境中适应性降低,生长速率较敏感株减慢,然而自然环境中的竞争使得耐药菌株需要通过基因进化来克服这个缺陷重新获得竞争力[30]。很多实验已经证明尽管有时在缺乏抗生素的条件下适应性降低的无毒力耐药株会回复突变成敏感株,但绝大多数都出现了通过补偿突变(compensatory mutation)即第2位点突变(second site mutation),在不丧失耐药性的同时来修复适应性和毒力。这也表明减少抗生素的使用可能并不能使已经出现在人体和环境中的耐药细菌消失,第2靶位的补偿突变能增加耐药株的适应性,使这些菌株在没有抗生素的环境中和敏感株成功竞争[30]。事实上临床耐药株可能已经适应了环境,补偿了耐药相关的适应性代价,从而引起耐药细菌的广泛传播。

表2 染色体突变引起的适应性降低的改善和补偿Table 2.Compensatory evolution and amelioration of fitness losses caused by chromosomal mutations

对细菌耐药性与适应性关系的研究,是对细菌耐药监测和耐药机制研究的重要补充,有助于我们更好理解细菌耐药性的发生机制和传播规律,进而探索阻遏细菌耐药性上升趋势的更合理策略。

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