响应面分析法优化鸡腿菇多糖的提取工艺

张东亮 王 薇 吴巧凤*

浙江中医药大学药学院（310053）

鸡腿菇，学名毛头鬼伞（Copyinds Comatus），又名刺蘑菇、鸡腿蘑，因形如鸡腿，营养丰富，肉质肉味如鸡丝而得名。目前它已被定为符合联合国粮农组织（FAO）和世界卫生组织（WHO）要求的集“天然、营养、保健”3种功能为一体的16种珍稀食（药）用真菌之一[1]。现代药理研究表明，鸡腿菇有效活性成分多糖具有降血糖、调血脂、抑菌、抗氧化，提高免疫力、抗肿瘤等多种生理活性作用[2-5]，因此对鸡腿菇资源的开发具有重要意义。目前鸡腿菇多糖多采用热水浸提[6]，超声波[7]或微波辅助提取[2]等方法，但仍以工艺简单，多糖提取率较高的统热水浸提的方法为主[3,6,8]。本试验旨在利用响应面分析法[9-11]，优化鸡腿菇多糖的热水浸提工艺。

1 仪器和试药

仪器：S22PC可见分光光度计（上海棱光技术有限公司）；R-201旋转蒸发器（上海申胜生物科技有限公司）；HH-S型水浴锅（巩义市英峪于华仪器厂）；SHZ-D循环水式真空泵（巩义市英峪于华仪器厂）。

试药：鸡腿菇干品产自浙江省丽水市，经浙江中医药大学药学院资源教研室俞冰副教授鉴定为Copyinds Comatus。葡萄糖标准品由中国药品生物制品检定所提供（批号110833-200503），其他试剂均为分析纯。

2 实验方法

2.1 鸡腿菇多糖的含量测定[12,13]

2.1.1 标准品溶液和供试品溶液的配制

标准品溶液：精密称取干燥至恒重的葡萄糖标准品1.0010g，入100mL容量瓶中并加蒸馏水稀释至刻度，摇匀得葡萄糖标准品储备液。从中移取1mL溶液加蒸馏水稀释，定容于100mL容量瓶中得浓度为0.1mg/mL的葡萄糖标准品溶液。

供试品溶液：分别准确称取鸡腿菇干品15份，每份5.0g，加20倍量80%乙醇于80℃水浴加热回流，趁热抽滤，反复3次，每次2h，残渣以热水浸提得鸡腿菇多糖溶液（具体操作步骤见表1和表2中的因素和水平），趁热抽滤，反复3次，合并滤液，浓缩后定容于100mL容量瓶，即得供试品溶液。

2.1.2 线性关系的考察

精密吸取葡萄糖标准品溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL，分别置于25mL比色管中，各加蒸馏水补至1mL，再各加5%苯酚溶液1.0mL，摇匀，迅速加入浓硫酸5.0mL，涡旋混匀后，冷却30min至室温后，以蒸馏水为空白对照，在490nm波长处于分光光度计上分别测定吸光度，得吸光度Y与浓度X的回归方程：Y=6.8271X＋0.0695，相关系数R=0.9994，表明葡萄糖在0～0.1mg/mL浓度范围内与吸光度呈良好的线性关系。

2.1.3 精密度试验

取葡萄糖标准品溶液 1mL，置于 25mL比色管中，其余操作按“2.1.2”项下方法进行。平行测定6次吸光度，结果RSD为0.93%，表明仪器的精密度良好。

2.1.4 稳定性试验

取供试品溶液1mL，定容于25mL容量瓶中，移取1mL溶液置于25mL比色管中，其余操作按“2.1.2”项下方法进行。分别于10、20、30、40、50、60min后测定吸光度，结果RSD为0.86%，表明在1h内吸光度稳定，故多糖含量测定应在显色后应在1h内完成测定。

2.1.5 加样回收率试验

取已知含量的供试品溶液9份，分别加入3个水平的葡萄糖标准品溶液，定容于25mL容量瓶中，从中移取1mL入25mL比色管中，其余操作按“2.1.2”项下方法进行，测定吸光度，计算加样回收率，9次加样回收率平均值为99.0%，RSD为2.94%，表明本测定方法可靠。

2.1.6 多糖的含量测定

分别移取供试品溶液各1.0mL，蒸馏水定容于25mL容量瓶，摇匀后各取1mL，置于25mL比色管中，其余操作按“2.1.2”项中方法进行，并在490nm波长处于分光光度计上测定吸光度，由回归方程计算多糖含量。结果见表2。

2.2 鸡腿菇多糖的提取工艺研究

2.2.1 响应面分析法因素的选取及方案分析

分别准确称取鸡腿菇干品5.0g，按“2.1.2”项下方法预处理得残渣，后根据Box-Behnken的中心组合实验设计原理，综合相关单因素实验数据，选取提取温度、料液比、提取时间3个因素，采用SAS（SAS Package Veion 9.1.3）对数据进行回归分析。以鸡腿菇多糖提取率作为响应值（Y）。方案及试验结果见表1和表2。

表1 响应面试验因素考察表

2.2.2 试验结果分析

采用SAS 9.1.3软件对表2的结果进行响应面回归分析，得拟合方程：Y=3.097442 + 0.244976X1- 0.070011X2+0.217385X3- 0.176271X1×X1+0.14432X1×X2- 0.030004X1×X3- 0.202157X2×X2+ 0.003289X2×X3-0.12838X3×X3，对回归方程进行显著性检验和方差分析，结果见表3。

表2 响应面试验安排及结果

表3 回归方程的显著性检验及方差分析结果

由表3可知，在置信区间95%时，线性相关系数为98.65%.可见回归方程具有较高的显著性，可用于替代试验点对实验结果进行分析，并进一步对回归方程各项进行显著性检验，见表4。

表4 回归方程各项的显著性检验结果

由表4可知，方程一次项、二次项、交互项对提取率影响都具有显著性差异。由此可见，各具体实验因素对响应面值的影响非简单的线性关系。同时做出等值线图和响应面图（图1～6），进行分析计算后得出理论最佳提取工艺条件为：提取温度：76.69℃，料液比：1∶20.19，提取时间：108.15min，在此条件下鸡腿菇多糖的理论提取率为26.03mg/g。结合实际生产条件和方差分析结果，确定最佳提取工艺为：加鸡腿菇药材20倍量的水，在77℃温度提取108min。

2.2.3 验证性试验

图1 y= f1(x1，x2)的等值线（x 3=0）

图2 y=f1(x1，x2)响应面值(x3=0)

图3 y=f2(x2，x3)等值线图(x1=0)

图4 y=f2(x2，x3)响应面图（x1=0）

图5 y=f3(x1，x3)等值线(x2=0)

图6 y=f3(x1，x3)响应面图(x2=0)

按照最佳热水浸提工艺进行验证性试验，提取3次，测得灵芝多糖的平均提取率为25.69mg/g，RSD为0.65%。表明该工艺稳定可行。

3 结 论

3.1 响应面分析法（response surface methodology，RSM）是一种优化反应条件和加工工艺参数的有效方法，广泛应用于化学化工、生物工程、食品工业等方面[14]。它与正交试验设计法不同，求得的回归方程精度高，能研究几种因素间交互作用等优点，并能够通过相应图寻求在整个区域上因素的最佳组合和响应值的最优值。

3.2 根据响应面分析确定鸡腿菇多糖的最佳提取工艺参数：浸提温度 77℃，料水比 1∶20，浸提时间108min。按照此工艺条件提取鸡腿菇多糖的提取率较高，可达 25.69mg/g，试验值比理论预测值基本吻合，说明建立的数学模型能较好的预测各因素同提取率之间的关系。

3.3 12号试验表明在浸提温度 80℃，料水比 1∶20，浸提时间120min条件下，提取率为26.48mg/g，比最佳工艺提取率稍高。但其提取过程中耗能大，且提取时间比最佳工艺长，不适合工业化大生产的需要。因此最终确定鸡腿菇多糖的最佳提取工艺参数为：浸提温度77℃，料水比 1∶20，浸提时间108min，多糖提取率为25.69mg/g。

3.4 鸡腿菇作为真菌中的“后起之秀”，因其较高的营养和药用价值而越来越受到重视。由本文研究及文献报道可知鸡腿菇含有较高的多糖，本文根据生产实际，确定了鸡腿菇多糖的热水浸提的最佳工艺，可为鸡腿菇多糖的进一步开发提供科学的实验依据。

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